在进行qPCR实验后,所得到的数据是否可靠,是一个值得关注的问题。如果数据不可靠,就算趋势符合预期,也不应当用。
一、Ct值的评估
对于qPCR 数据的质量评估，首先要关注的是 Ct 值。Ct 值是衡量实验中目的基因表达水平的重要指标。通常情况下，我们依据以下标准来评估 Ct 值的结果：①优秀:内参基因的 Ct 值在 14-18 之间，目的基因的 Ct 值也应在 14-18 之间。②良好:内参基因的 Ct 值在 12-20 之间，而目的基因的 Ct 值应在 14-32 之间。③勉强可用:内参基因的 Ct 值在 10-22 之间，同时目的基因的 Ct 值则应在 14-35 之间。然而，若目的基因的 Ct 值超过 35，虽然仍然可以使用这些数据，但可能会对实验结果的准确性产生影响，导致结果的偏差较大。所以，若发现 Ct 值偏高，建议重新进行实验以确保结果的准确性。
二、溶解曲线的检查
在获取Ct值后，我们需要仔细审视溶解曲线，以确保实验结果的准确性和可靠性。在检查溶解曲线时，需要关注以下几个方面：
1.熔点(TM):熔点应该位于75-90℃之间，这是一个合适的范围。
2.峰型:峰型应该是单峰的，不应该存在任何杂峰。
3.峰距:在理想情况下，峰距应该在5个TM单位内，这样可以确保实验结果的准确性和可靠性。
三、扩增曲线的观察
虽然扩增曲线可能不是大家经常关注的点,但它同样重要:
1.平台期:需要观察曲线是否有明显的平台期。平台期的清晰度对于结果的准确性和可靠性至关重要。
2.荧光强度(Fluorescence):观察荧光强度是否符合要求，一般来说，荧光强度应该至少大于3，这有助于确保扩增的信号强度足够清晰。
3.二次抬头:避免曲线出现二次抬头的情况，即曲线不应该在扩增过程中再次上升。这种情况可能会影响我们对扩增过程的准确理解，因此需要特别注意。
