一、自然纯化

1.原理：

利用某一种类细胞的增殖优势，排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，从而达到细胞纯化的目的。

2.特点：

操作简单：不需要复杂的操作和设备，只需长期传代培养即可。

无法人为选择细胞：无法按照实验要求和目的来选择特定的细胞类型。

时间长：纯化过程可能需要较长时间，且纯化效果有限。

适用对象：主要适用于肿瘤细胞和成纤维细胞等细胞系的建立。

3.应用实例：

某些恶性变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过自然纯化方法不断纯化而建立细胞系。

 

二、人工纯化

人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。具体方法包括：

1.酶消化法

原理：

利用不同细胞对酶的耐受能力差异，通过胰蛋白酶等消化酶将细胞消化分离。例如，上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁。

步骤：

将胰蛋白酶注入培养瓶内，覆盖细胞表面。

在显微镜下观察，当纤维样细胞变圆、部分脱壁时，立即加入有血清的培养基终止消化。

用吸管轻轻吹打成纤维细胞生长的区域，使其悬浮在培养基中，然后去除。

重复上述操作多次，以达到纯化上皮细胞的目的。

特点：

适用范围广：适用于贴壁细胞、半贴壁细胞和黏附细胞等。

操作复杂：需要精确控制消化时间和消化酶的浓度。

纯化效果好：可以有效分离不同类型的细胞。

 

2.机械刮除法

原理：

利用机械方法去除不需要的细胞区域，保留需要的细胞区域。

步骤：

将培养瓶置于显微镜下，找出不同细胞类型的生长区域。

用细胞刮刀或弯头吸管在不需要生长的细胞区域推划，使细胞悬浮在培养基中。

用培养基冲洗培养瓶，去除悬浮的细胞。

重复上述操作多次，以达到纯化细胞的目的。

特点：

操作简单：不需要复杂的设备和试剂。

纯化效果有限：可能无法完全去除所有不需要的细胞。

易污染：操作过程中需要严格无菌操作，防止污染。

 

3.反复贴壁法

原理：

利用成纤维细胞和上皮细胞的贴壁速度差异进行纯化。成纤维细胞贴壁速度快，而上皮细胞贴壁速度慢。

步骤：

将细胞悬液接种在一个培养瓶内，静置一段时间。

在显微镜下观察，当部分细胞贴壁时，将未贴壁的细胞悬液倒入另一个培养瓶中，继续静置培养。

重复上述操作多次，将上皮细胞和成纤维细胞逐步分隔开。

特点：

操作简单：不需要复杂的设备和试剂。

纯化效果较好：可以有效分离成纤维细胞和上皮细胞。

适用范围有限：主要适用于贴壁细胞。

 

4.培养基限定法

原理：

基于不同细胞对特定物质的需求差异进行纯化。某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则将无法生长。而其他细胞与之相反。

步骤：

在培养基中添加或去除某种特定物质，以限制非目标细胞的生长。

培养一段时间后，收集目标细胞进行纯化。

特点：

操作灵活：可以根据不同细胞的需求调整培养基成分。

纯化效果好：可以有效筛选出目标细胞。

适用范围广：适用于多种类型的细胞纯化。

 

5.细胞克隆技术法

原理：

从细胞群体中分离出单个细胞，使之在体外培养体系中生长繁殖成新的细胞群体（克隆）。通过筛选不同克隆，选择出所需的特定细胞类型。

步骤：

采用有限稀释法或显微操作法将细胞群体中的单个细胞分离出来。

将单个细胞接种在培养皿中，进行体外培养。

培养一段时间后，形成多个细胞克隆。

对每个克隆进行测试，选择出所需的特定细胞类型。

特点：

纯化效果高：可以获得高纯度的目标细胞。

操作复杂：需要精细的操作和大量的时间。

适用范围广：适用于多种类型的细胞纯化。

 

6.流式细胞仪分离法

原理：

流式细胞仪可根据细胞核酸含量、某些物质含量、细胞结构及细胞大小等参数，将细胞分离成不同的群体。

步骤：

将细胞悬液注入流式细胞仪中。

流式细胞仪对细胞进行高速分析，并根据设定的参数将细胞分离成不同的群体。

收集目标细胞进行纯化。

特点：

纯化效率高：可以快速、准确地分离出目标细胞。

设备昂贵：需要专业的流式细胞仪设备。

适用范围广：适用于多种类型的细胞纯化。

 

总结

自然纯化和人工纯化是细胞纯化的两种主要方法。自然纯化方法简单，但无法人为选择细胞，纯化效果有限；人工纯化方法灵活多样，可以根据不同细胞的需求选择合适的纯化方法，纯化效果较好。在实际应用中，可以根据实验要求和目的选择合适的方法，或者结合多种方法进行综合纯化。