一、培养前的准备
1.培养基配制
推荐使用MEMα（改良Eagle培养基）作为基础培养基，加入10%的优质胎牛血清（FBS）和1%的双抗（青霉素/链霉素）。
注意：不同实验室或供应商可能推荐不同的培养基配方，如DMEM-H+10%FBS等，具体选择应根据实验需求和细胞特性确定。
2.培养环境设置
将细胞培养箱设置为37℃，气相为空气95%、二氧化碳5%，湿度保持在70%-80%。
3.培养器具准备
使用无菌的培养瓶、离心管、移液器等器具，确保所有器具在使用前已经过高温高压灭菌。
二、细胞复苏
1.快速解冻
将含有MC3T3-E1细胞的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中摇晃解冻，确保在1分钟内完全融化。
2.离心重悬
将解冻后的细胞悬液转移至含有4-6mL完全培养基的离心管中，轻轻混匀。
在1000RPM条件下离心3-5分钟，弃去上清液。
加入1mL完全培养基，轻轻吹打重悬细胞。
3.接种培养
将重悬后的细胞悬液接种至新的培养瓶中，加入适量的完全培养基（如6-8mL），放入培养箱中静置培养。
第二天观察细胞贴壁情况，并更换新鲜培养基。
三、细胞传代
1.观察细胞密度
当细胞密度达到80%-90%时，需要进行传代培养。
2.消化细胞
弃去原培养基，用不含钙、镁离子的PBS缓冲液润洗细胞1-2次。
加入适量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（如T25瓶中加入1-2mL），轻轻晃动培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞表面。
将培养瓶放入培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况，当细胞边缘缩小、贴壁松动时，迅速加入3-4mL含10%FBS的完全培养基终止消化。
3.离心重悬
轻轻吹打细胞悬液，使细胞完全脱落并分散成单个细胞。
将细胞悬液转移至离心管中，在1000RPM条件下离心3-5分钟，弃去上清液。
加入适量的完全培养基，轻轻吹打重悬细胞。
4.接种传代
将重悬后的细胞悬液按1:2至1:5的比例接种至新的培养瓶中，加入适量的完全培养基，放入培养箱中继续培养。
四、细胞冻存
1.选择冻存时机
当细胞生长状态良好时，可以选择部分细胞进行冻存，以备后续实验使用。
2.消化离心
按照细胞传代的步骤消化细胞，并进行离心。
3.配制冻存液
使用90%的FBS和10%的DMSO（二甲基亚砜）配制冻存液，现用现配。
4.重悬冻存
将离心后的细胞沉淀用冻存液轻轻重悬，调整细胞密度至1×106−1×107个活细胞/mL。
将细胞悬液分装至无菌的冻存管中，每管1mL左右。
在冻存管上标注细胞名称、代数、冻存日期等信息。
5.梯度降温
将冻存管放入程序降温盒中，放入-80℃冰箱过夜。
第二天将冻存管转入液氮罐中长期保存。
五、注意事项
1.无菌操作
在整个培养过程中，应严格遵守无菌操作规程，防止细胞污染。
2.培养基更换
根据细胞生长情况和培养基颜色变化，定期更换新鲜培养基，通常每2-3天更换一次。
3.细胞观察
定期检查细胞生长情况，观察细胞形态、密度和贴壁状态，及时发现并处理异常情况。
4.细胞保种
对于珍贵的细胞株，应及时进行冻存保种，以防止细胞丢失或变异。
