一、破骨细胞概述

破骨细胞是一种独特的多核细胞，源自造血干细胞分化而来的巨噬细胞，专门负责骨吸收过程。RANKL/RANK/OPG信号通路是调控破骨细胞分化的核心枢纽，可精密调控破骨细胞与成骨细胞的活性平衡，确保骨骼稳态。

 

二、破骨细胞培养方法

目前，破骨细胞主要采用诱导法培养，常用的是骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。

1. 骨髓单核细胞诱导法

（1）实验材料

实验动物：8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠

试剂：PBS溶液、α-MEM培养基、红细胞裂解缓冲液、FBS、M-CSF、RANKL、TRAP染色试剂盒等

器材：离心管、注射器、细胞筛网、培养皿、盖玻片等

（2）实验步骤

取材与消毒

选用8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠，采用CO₂吸入法将其安乐死后，浸泡于50mL 75%乙醇中5分钟进行消毒。

骨髓细胞提取

无菌操作下完整取下小鼠后肢，剔除股骨和胫骨上多余的皮肤与肌肉组织，随后将骨头置于10mL含有2%青霉素-链霉素的PBS溶液（4℃预冷）中。

分离胫骨和股骨，用2mL含2%青霉素-链霉素的PBS溶液清洗两次，每次5分钟。

用10mL注射器（配备25G针头）向骨头两端注入α-MEM，将骨髓细胞冲洗出来，然后将这些细胞通过70μm细胞筛网过滤到一个50mL的离心管中。反复冲洗直至骨髓腔内不再有明显的红色残留。每块骨使用约8mL的α-MEM进行冲洗，以收集细胞，并将所有骨髓细胞在室温下临时保存于50mL的锥形管中。

红细胞裂解

室温下400×g离心5分钟，弃去上清液，加入3mL红细胞裂解缓冲液，室温静置2-3分钟裂解红细胞。

加入5mL含10% FBS的常温α-MEM培养基终止裂解，300×g离心3分钟，弃上清。

细胞培养

将细胞重悬于20mL含20-50ng/mL M-CSF的完全培养基中，转移至两个10cm培养皿，在37℃、5% CO₂的培养箱中过夜培养。

12小时后，收集未贴壁的细胞，接种至10cm培养皿中继续培养，培养基为含10% FBS和20-50ng/mL M-CSF的α-MEM培养基。每隔一天换液，培养2-3天，直至贴壁细胞达到80%-90%融合。

破骨细胞诱导

提前在24孔板中放置盖玻片，收获骨髓细胞，以终浓度为1.6-2.0×10⁶ cells/mL、每孔0.5mL的量接种到放有盖玻片的24孔板中，培养基为含20-50ng/mL M-CSF的α-MEM培养基。

12小时后，更换为含有20-50ng/mL M-CSF和50-100ng/mL RANKL的10% FBS的α-MEM培养基，此后每隔一天换液，诱导6-8天，期间破骨细胞在第4-5天形成。

破骨细胞鉴定

按照TRAP染色试剂盒说明书对24孔板中的细胞进行染色，在显微镜下观察，具有三个或更多细胞核且呈深红色至紫色的TRAP阳性细胞即为破骨细胞。注意：破骨细胞诱导成熟后，请尽快进行TRAP染色，24小时后破骨细胞会破碎。

2. RAW264.7细胞系诱导法

（1）实验材料

细胞系：RAW264.7细胞系

试剂：α-MEM培养基、FBS、RANKL、TRAP染色试剂盒等

器材：培养皿、离心管、移液器等

（2）实验步骤

细胞培养

常规培养RAW264.7细胞于含10%FBS的DMEM中，置于37℃、5%CO₂的加湿培养箱中，每隔一天更换培养基。

当细胞汇合度达到80%-90%时，用移液器或巴氏管将细胞轻轻吹下，避免使用胰酶消化，收集细胞后以1:2~1:3的比例传代。

细胞接种

用含10%FBS的α-MEM培养基将RAW264.7细胞制成细胞悬液，以2×10⁴ cells/孔的密度接种于24孔板中。

破骨细胞诱导

细胞接种12小时后，加入100-150ng/mL RANKL。

每3天更换培养基，并同时补加20-100ng/mL RANKL。

较为明显的多核破骨细胞将在分化培养4天后开始出现，并在第5天至第6天逐渐变得丰富。

破骨细胞鉴定

进行TRAP染色，鉴定破骨细胞。

 

三、注意事项

1.无菌操作：在骨髓单核细胞提取和细胞培养过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免污染。

2.细胞因子浓度：M-CSF和RANKL的浓度应根据实验条件和细胞状态进行调整，以获得最佳的破骨细胞诱导效果。

3.细胞状态观察：在细胞培养过程中，要密切观察细胞状态，及时处理异常情况。

4.TRAP染色时机：破骨细胞诱导成熟后，应尽快进行TRAP染色，以免破骨细胞破碎影响染色结果。