ELISpot结合了细胞培养技与ELISA技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理就是用抗体捕获细胞分泌的细胞因子，并通过酶促反应，将该细胞显示出来。该技术灵敏度高，在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。目前在疫苗领域，使用ELISpot评价疫苗细胞免疫的应用十分广泛。现在各种常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒，使用起来非常方面。能商业化检测的细胞因子包括人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素（γ-IFN）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、颗粒酶（Granzyme B）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。

下实验方案是使用特异性或者非特异性抗原刺激PBMC产生干扰素-γ（IFN-γ）的细胞数量检测的一个例子，供初学者参考。

实验步骤：

第一天捕获抗体包被（商业化试剂盒已包被）

1. 每孔加入15 μL 35%乙醇浸润一分钟。随后立即用150 μL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次。

注意：乙醇体积不建议超过15 μL。膜预湿后，在整个实验期间不要让膜干燥。2. 在ELISpot板中每孔加入100 μL（10 μg/mL）抗IFN-γ抗体（PBS稀释），4℃下过夜孵育。

第二天膜封闭

1. 弃掉捕获抗体溶液。

2. 每孔用150 μL无菌去离子水清洗两次。

3. 每孔用150 μL细胞培养基（RPMI-1640，10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，青霉素，链霉素，谷氨酰胺）封闭膜，至少在37℃下孵育2小时。人外周血单个核细胞制备1. 使用Ficoll™密度梯度离心法从新鲜抽取的含抗凝剂全血中纯化人外周血单个核细胞（PBMC）。

注意：如果是冻存复苏后的PBMC，建议在细胞培养基中37℃下孵育2小时。

2. 使用冷的无菌PBS清洗细胞，计数并在细胞培养基中重新悬浮，最终浓度为0.25 ~ 2 × 106个细胞/mL。

注意：所需细胞浓度取决于免疫反应的强度。如果预期反应未知，建议进行细胞浓度的系列稀释。

3. 使用细胞培养基制备2X浓度的抗原或者激活剂，如PHA、CEF肽等。

细胞铺板

1. 倒掉封闭培养基。

2. 每孔轻轻加入50 μL PBMC悬液和50 μL刺激剂。

注意：每孔不超过200,000个细胞。

3. 在37℃，5% CO2和95%湿度下孵育18至48小时。

4. 建议在实验中加入以下对照孔：

a) 阳性对照——使用重组小鼠IFN-γ。

b) 未刺激/阴性对照——使用与刺激细胞相同数量的未刺激细胞。

c) 背景对照——使用无菌培养基。

d) 检测抗体对照——用PBS代替检测抗体。

第三天检测抗体孵育

1. 吸弃细胞。

2. 用含0.05% Tween 20的PBS（PBST）洗板6次，每孔300 μL。

注意：使用洗瓶能够确保充分洗涤。如果使用板洗机，务必增加洗涤次数至8次。

3. 将生物素化的抗IFN-γ抗体使用0.5% BSA/PBS稀释至2 μg/mL。每孔加入100 μL。

4. 在37℃，5% CO2和95%湿度下孵育2小时。

5. 用PBST洗板6次。

酶结合和底物显色

1. 按说明书稀释链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶（Streptavidin-AP Conjugate）。每孔加入100 μL链霉抗生物素-碱性磷酸酶。在室温下孵育1小时。

注意：不同厂家的酶浓度可能存在差异，工作浓度及孵育时间需要适当调整。

2. 吸弃酶偶合物（Conjugate），使用PBST清洗3次，然后用PBS洗3次。

注意：最后的PBS洗涤非常重要，因为Tween 20会干扰斑点的显色。

3. 每孔加入100 μL BCIP/NBT底物。避光孵育5分钟。

注意：底物显色时间非常关键。不同底物浓度显色时间可能有所不同。

4. 从微孔板中倒出BCIP/NBT底物溶液，并用去离子水冲洗微孔板。翻转微孔板并敲击以去除多余的水。从微孔板底部取出柔性塑料暗沟，用纸巾彻底擦拭板底部，并在室温（60-90分钟）或37°C（15-30分钟）下完全干燥。

5. 使用成像系统分析板中斑点数量。