Western Blot（WB）是定性检测蛋白磷酸化水平的常用方法，以下是一些关于如何轻松搞定磷酸化蛋白的WB检测的建议：
一、实验准备
1.样品准备：
磷酸化是一个迅速的反应，因此取样品的过程要迅速，样品要新鲜，样品处理最好在冰上操作，操作时间尽量短。
用PBS洗涤细胞时，PBS需4℃预冷。如果是组织，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温状态。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，裂解液中需加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（如okadaic acid、NaF），以防止蛋白降解和磷酸酶去磷酸化作用。
根据检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，可能还需要加入其他抑制剂，如检测酪氨酸磷酸化时，需加入1μM的原钒酸钠。
2.抗体选择：
选择特异性好、灵敏度高的磷酸化抗体，这是WB检测成功的关键。
抗体需来自可靠的厂商，以保证抗体的质量和稳定性。
二、实验步骤
1.蛋白定量与上样：
使用BCA等方法对蛋白进行定量，确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。
将样品与上样缓冲液混合，遏制磷酸酶活性。上样前不要煮沸，以免破坏磷酸化位点。
2.SDS-PAGE分离与转膜：
使用SDS-PAGE凝胶对蛋白进行分离。
将分离后的蛋白转移到PVDF膜上，注意保持膜的湿润和完整性。
3.抗体孵育与检测：
使用特异性识别磷酸化蛋白的抗体进行孵育，孵育时间需足够长，以确保抗体与磷酸化蛋白的充分结合。
孵育结束后，使用洗涤液进行充分漂洗，以去除未结合的抗体。
使用化学发光或荧光底物进行检测，观察并记录结果。
三、实验优化与注意事项
1.提高检测灵敏度：
对于丰度低的磷酸化蛋白，可以先通过免疫沉淀（IP）等方法对目标蛋白进行富集，再进行WB检测。
使用高灵敏度的底物进行化学发光检测，以提高检测灵敏度。
2.减少非特异性结合：
在抗体孵育前，使用封闭液对膜进行封闭，以减少非特异性结合。
选择特异性好的抗体，避免抗体与样品中的其他蛋白质发生非特异性结合。
3.实验条件控制：
保持实验条件的稳定性和一致性，如温度、湿度、pH值等。
避免反复冻融样品和抗体，以减少蛋白降解和抗体失活。
4.数据解读与验证：
根据Markers比对压出的条带分子量是否正确。
使用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜检测总蛋白水平，以确定磷酸化组分的相对比例是否有变化。
如有必要，可采用其他方法进行验证，如质谱分析等。
综上所述，通过精心准备实验材料、优化实验步骤和注意实验条件控制等措施，可以轻松搞定磷酸化蛋白的WB检测。同时，也需要根据具体实验需求和条件进行灵活调整和优化。
