光实验中的自发荧光确实是一个令人头疼的问题，它可能来源于生物组织中的某些天然成分，这些成分在受到特定波长的光激发后会发出荧光，从而干扰目的荧光信号的检测。

以下是一些可以帮助减少或去除自发荧光干扰的技巧：

一、选择适当的荧光蛋白和标记方法

1.选择近红外荧光蛋白：绿色、红色荧光蛋白的荧光信号虽然强，但易受组织深度、自发荧光的干扰，检测效果不佳。近红外荧光蛋白的激发和发射波长较长，可以更有效地穿透组织并减少自发荧光的干扰。

2.使用荧光素酶（LUC）：LUC的发光需要与底物发生化学反应才能产生，属于化学发光现象，无需使用激发光激发，因此可以有效避免活体成像时自发荧光的干扰。

二、活体成像观察的优化

1.动物剃毛：毛发中富含弹性蛋白等物质，易产生自发荧光。因此，在观察前可将对应的部位进行剃毛处理，以避免毛发自发光的影响。

2.饲料荧光控制：涉及消化道方面的成像时，至少提前一星期使用无荧光饲料喂养动物，以避免食物中可能含有的荧光物质的影响。

3.选择高灵敏度成像系统：高灵敏度的成像系统可以一定程度上提高检测效果，减少自发荧光的干扰。

三、组织切片观察的优化

1.冰冻切片与石蜡切片的选择：

冰冻切片：不会破坏荧光蛋白的构象，可以直接观察荧光蛋白的荧光。但冰冻切片若是出现自发荧光干扰，目前似乎还没有比较好的解决方法。实验前若考虑到这点或者所检测的组织有报道可能存在明显的自发荧光时，可以做预实验先观察目标组织的自发荧光情况，再决定正式实验的取材方式和检测方法。

石蜡切片：在固定过程中可能会影响荧光蛋白的构象，导致无法被正常激发出荧光。此时可采用免疫荧光的方式观察组织中的荧光蛋白，以判断感染效率。但石蜡切片的自发荧光也很强，需要采取额外措施来减少干扰。

2.减少石蜡切片自发荧光的方法：

严格去除切片上的石蜡残留：所有石蜡切片在染色前都需要通过二甲苯去除石蜡。可以将这一步的时间延长至平时的一倍，即二甲苯

①、二甲苯②、二甲苯③至少各停留30分钟。同时，烤片1小时左右可以提高脱蜡效率，使组织与玻片贴得更紧。

血清封闭：采用高质量的动物血清在室温下封闭1~2小时（或更长时间，如37℃孵育箱中封闭2小时），以充分去除组织中的类属抗原。

使用非醛类固定剂：如冰乙醇，可有效降低因醛类反应所产生的自发荧光。

阴性对照：确定切片脱蜡之后，在不加二抗的情况下观察是否还能继续发荧光，以判断是否存在自发荧光。

自发荧光淬灭剂：自发荧光淬灭试剂中的离子可通过碰撞方式捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态和能量释放，从而淬灭自发荧光。但需要注意的是，淬灭剂会在一定程度上降低抗体荧光强度。

四、其他注意事项

1.抗体的选择与使用：尽可能选用大品牌的、评价良好的单克隆抗体进行免疫荧光标记实验。抗体的浓度需要预实验摸索，最好采用“棋盘法”进行浓度梯度预试。一抗浓度过高也是造成自发荧光强的重要原因之一。

2.二抗的孵育与漂洗：二抗孵育的时间非常重要，需要通过充分的预实验来摸索二抗孵育时间和温度。同时，在二抗孵育结束后的漂洗中要充分漂洗以减少自发荧光。至少二抗之后的漂洗要尽可能多洗几遍（如5分钟×5次）。

3.图像采集与处理：使用共聚焦显微镜进行图像采集可以获得更好的效果。在图像采集时可以从整体上对图像进行调整，如使用显微镜自带的图像软件上的“伽马值”选项来从整体上调节图像的亮度和对比度（一般设定在0.75~1.0之间）。

综上所述，通过选择适当的荧光蛋白和标记方法、优化活体成像观察和组织切片观察的条件以及注意其他实验细节等措施，可以有效地减少或去除荧光实验中的自发荧光干扰。