一、实验原理
碘克沙醇（Iodixanol）是一种高亲水性非离子型的物质，其密度和渗透性成线性关系。在加入适当浓度的缓冲液或基本培养基后，碘克沙醇能形成等渗的密度梯度溶液。利用这一特性，可以分离不同密度的细胞器。
二、实验试剂与器材
1.试剂
OptiPrep™（600g/L的碘克沙醇溶液）
匀浆介质：包含0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、20mmol/L Hepes-NaOH，pH值为7.4
OptiPrep™稀释液：包含0.25mmol/L蔗糖、6mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、120mmol/L Hepes-NaOH，pH值为7.4
碘克沙醇（500g/L）工作液（IWS）：由5体积OptiPrep™和1体积OptiPrep™稀释液混合而成
蛋白酶抑制剂（按要求加入匀浆介质和OptiPrep™稀释液中）
使用匀浆介质制备好的轻线粒体组分
2.器材
Dounce匀浆器（宽松配制，Wheaton B型）
两室梯度制备仪或Gradient Master™
5ml规格注射器（内径大约为0.8mm），带金属套管针
超速离心机，配有吊桶式转子（离心管容量为17ml）
梯度收集器，用于收集低密度或高密度的梯度液
三、实验步骤
所有操作均在0~4℃下进行，以确保细胞器的完整性和稳定性。
1.制备梯度溶液
使用匀浆介质稀释碘克沙醇工作液，获得碘克沙醇浓度为190g/L及270g/L的梯度溶液，将溶液置于冰上。
2.重悬轻线粒体沉淀
使用宽松配制的Dounce匀浆器（用研杵研磨2~3次），在3.0ml的匀浆介质中重悬轻线粒体沉淀。
3.调整混悬液浓度
使用碘克沙醇工作液将混悬液碘克沙醇浓度调整到300g/L。
4.制备线性梯度
使用两室梯度制备仪或者Gradient Master™从两种梯度溶液中各取6ml来制备线性梯度，置于可在吊桶式转子中离心的管中。
5.铺入混悬液
使用注射器和金属套管针在梯度溶液下铺入3~4ml在第3步制备的混悬液。
6.铺入匀浆介质
在梯度溶液顶层铺1~2ml匀浆介质，使得管中液面离顶部大约3mm。
7.离心分离
在适宜的吊桶式转子中以大约70000g的离心力离心1.5~2小时。
8.收集梯度液
离心结束后，可以使用密度高的介质向上取代或者在凹液面上吸出来的方法先收集梯度溶液中1ml低密度部分。或者，通过管刺破或小心地用细的金属套管针探入管子的底部（与蠕动泵连接）来先收集密度高的组分。
四、实验注意事项
1.操作温度：所有操作均在0~4℃下进行，以防止细胞器降解和变性。
2.离心条件：离心力和离心时间的选择应根据实验需求和离心机的性能进行优化。
3.样品处理：在制备梯度溶液和铺入混悬液时，应确保样品的均匀性和稳定性。
4.梯度收集：在收集梯度液时，应小心操作，避免对样品造成污染和损失。
五、实验应用
碘克沙醇梯度溶液分析主要细胞器的方法在细胞生物学、生物化学和分子生物学等领域具有广泛的应用。例如，可以用于研究细胞器的结构和功能、分析细胞器的相互作用以及探索细胞器的动态变化等。
