一、样本制备
1.快速工作并保持低温环境
在样本制备过程中，应尽可能快地处理样品，以减少蛋白质降解的可能性。同时，保持操作环境在低温下进行，有助于维持蛋白质的稳定性和活性。
2.等量分装样品
如果需要对样品进行分装，请确保每份样品的量相等，以便后续实验中对不同样品进行比较。同时，这也有助于检查在样本制备过程中是否有目标蛋白质丢失。
3.优化裂解液的使用
对于浓度非常低的样品，建议使用高灵敏度底物和较少的裂解液，以提高检测的灵敏度。
如果裂解液中含有大量的DNA，可能会导致样品粘稠，难以移液，并可能在凝胶上产生条纹或污迹。此时，可以在添加上样缓冲液之前向裂解液中添加DNA酶。
4.变性凝胶的处理
在电泳前，将样品在98°C加热5分钟，可以使样品完全变性，并确保得到干净锐利的条带。
5.使用过滤后的缓冲液
在电泳前，应仔细检查缓冲液，确保其没有沉淀。使用过滤后的缓冲液可以减少对实验结果的影响。
6.小心操作凝胶梳子
在取下凝胶梳子时，请非常缓慢地进行，以免孔塌陷或扭曲，影响上样效果。
7.准确上样
使用上样器进行上样，确保将尖端尽可能靠近孔的底部，缓慢地加入样品，并小心地将上样器取出。在每个孔中加载相同的体积，不要空位。
二、转印过程
1.确保“三明治”结构材料尺寸相同
在转印过程中，滤纸、膜和凝胶的尺寸应相同，以防止气泡出现在膜上。气泡会影响蛋白质的转移效率，降低实验结果的准确性。
2.小心处理凝胶
从胶板中取出凝胶时，不要拉伸凝胶，以免损坏凝胶结构。用刀片从凝胶上取下底部和孔后，在凝胶上放置几片预先湿润的滤纸，轻轻地将其弄平。滤纸将作为支撑，小心地剥离凝胶。
3.去除气泡
使用圆形工具轻轻驱赶气泡，动作要轻柔，以免扭曲凝胶。气泡会影响蛋白质的转移效率，降低实验结果的准确性。
4.选择合适的转印方法
湿转：需要冰浴条件，适合大蛋白的转印。虽然相对较慢，需要大量的缓冲液，但可以获得高质量、清晰的条带和高效的转移。
半干转：比湿转快，使用较少的缓冲液，但比湿转效率低，特别是对于大蛋白。不需要冷却的环境，产热影响小。滤纸和膜剪裁时长宽应比凝胶小几毫米，否则影响蛋白质转移效率。
5.优化转印条件
根据蛋白质的大小和性质，调整转印条件，如电压、电流和时间等。对于大蛋白，可能需要使用低浓度的丙烯酰胺凝胶，并增加SDS和转印时间等。
6.使用高质量的膜和滤纸
选择高质量的膜和滤纸，如PVDF膜和硝酸纤维素膜等，可以提高蛋白质的转移效率，降低实验结果的变异性。
7.标准化数据
使用总蛋白质染色或加载对照抗体来标准化数据，可以提高实验结果的准确性和可靠性。例如，使用AzureRed总蛋白染色剂与荧光Western blot实验兼容，可进行多重荧光检测，定量更准确，使用更方便。
