1.控制样品起始量：

对于绝大多数类型的土壤，建议的样品起始量为2克。对于含水量较高的底泥样品，由于实际土壤含量较低，微生物含量也不高，起始量可适当增加到5克。

如果样品加入到研磨珠套管后，发现上面有一层水，最好先离心并吸去多余的水分。

2.使用正确的酚氯仿异戊醇（PCI）：

PCI是提取RNA时常用的有机试剂，用于裂解细胞并去除蛋白质。PCI的比例必须为25:24:1，pH值介于6.7-8之间，并保存在pH8.0的TE缓冲液中。

对于土壤样品，使用pH中性的苯酚更为合适。

3.优化异丙醇浓缩步骤：

在PCI裂解步骤后，加入SR3溶液，然后加入异丙醇沉淀总核酸。

对于底泥样品，由于加完SR3溶液后总体积可能较大，应增加异丙醇的使用量，以保证充分沉淀核酸。

4.注意异丙醇沉淀的环境温度：

标准操作建议在-20℃冷冻样品进行异丙醇沉淀。然而，对于盐浓度高的样品，核酸沉淀步骤最好在室温下进行，以避免冷冻样品沉淀的盐分改变核酸吸附条件。

正常的RNA沉淀表面平坦有光泽，若沉淀明显较大且表面有壳，则表明可能有盐分沉积。

5.加速阴离子交换离心柱的溶液流动：

在最后的RNA回收步骤中，使用的离心柱装有树脂，溶液利用重力通过离心柱。有时溶液通过树脂的速度很慢，可适当施加正压加速流动。

通常使用5毫升注射器针管缓缓加压，但流速不应超过1滴每秒。

6.充分摇匀SR5和SR6：

在使用前，必须充分摇匀SR5和SR6等溶液。有些含有异丙醇的溶液静置会分层，摇匀后才能确保溶液的有效成分均匀分布。

7.节省洗提时间：

在洗脱RNA时，可以直接洗脱到2毫升的收集管中，而不需要使用15毫升的收集管。这样可以节省时间和试剂，并确保离心柱垂直放置不会倾覆。

8.最后异丙醇沉淀：

从离心管中洗脱下来后，加入异丙醇进行最终沉淀。这一步必须在-20℃孵育，可以适当延长时间。

如果提取工作无法继续完成，可以在此步暂停过夜。样品在-20℃冷冻时，RNA能够稳定保存。

9.离心分离RNA：

离心异丙醇以分离RNA。正常的RNA沉淀应小而呈玻璃光泽。离心时，所有的收集管要朝向一致，以便于倒出异丙醇时迅速辨认RNA沉淀。

晾干RNA沉淀的步骤需要快速完成，通常可以在超净台中把收集管倒置在吸水纸上。

10.重悬RNA：

根据逆转录对体积的要求，用适量的水重悬RNA沉淀。

如果样品土壤微生物非常丰富，可以使用50-100微升水重悬（通常最终浓度为100-200纳克/微升）。对于底泥或干燥土壤等微生物含量低的样品，为了提高最终RNA浓度，可以使用25微升水重悬。

此外，用SR6溶液洗脱RNA后，离心柱滤膜上可能还留有DNA。可以使用含有高浓度盐的溶液将基因组DNA洗脱下来。由于整个核酸提取过程动作相对温和，因此可以获得更大分子量的DNA。这也是阴离子交换离心柱的又一优势，即可以从同一个样品中先后提取到RNA和DNA。

额外提示：

1.RNA稳定性和土样保存：采样后，可以使用专门的土壤RNA保护溶液（如LifeGuard Soil Preservation Solution）对土壤RNA进行保护，以确保在运输过程中微生物结构稳定不变。

2.避免使用不兼容的保存剂：RNALater等保存剂并不兼容土壤样品，可能会释放更多的腐植酸，粘附在RNA上难以去除。