在Western Blot实验中，内参的选择确实不容忽视。内参，即内部参照（Internal Control），是指在细胞生长过程中或特定的环境下，在各组织和细胞中的表达相对恒定，且在处理因素作用条件下不会发生表达改变的基因，用以控制上样量，确保目标蛋白变化具有可比性。以下是选择Western Blot内参时应考虑的几个关键因素：
1. 样本种属来源
哺乳动物样本：对于哺乳动物的组织或细胞样本，常用的内参包括β-actin、β-tubulin、GAPDH、Histone H3、COX IV、HSP60等。这些内参在大多数哺乳动物细胞中表达稳定，且表达量适中，易于检测。
植物样本：对于植物样本，常用的内参包括Plant actin、Rubisco等。
其他来源样本：对于其他来源的样本，如细菌、病毒等，应参照相关文献报道，选择合适的蛋白作为内参。
2. 目的蛋白分子量
分子量差异：选择内参时，应确保内参蛋白与目的蛋白的分子量有明显差异，一般建议分子量相差5kDa以上，以避免在电泳分离时条带重叠，影响结果判读。
避免竞争：内参蛋白与目的蛋白的分子量差异足够大，还可以减少抗体在检测过程中的竞争效应，提高检测的准确性。
3. 目的蛋白表达部位
细胞定位：内参蛋白与目的蛋白最好具有相似的细胞定位。例如，如果目的蛋白主要在胞浆中表达，那么选择胞浆蛋白如β-actin或GAPDH作为内参更为合适；如果目的蛋白在细胞核中表达，则应选择核蛋白如Histone H3作为内参。
细胞器特异性：对于不同细胞器（如线粒体、内质网等）的蛋白检测，应选择该细胞器特异性的内参蛋白。
4. 内参蛋白的表达稳定性
稳定性要求：内参蛋白的表达水平应在不同组织样本、处理条件或实验时间点下保持稳定，不受实验条件的影响。例如，在某些病理条件下（如缺氧、糖尿病等），GAPDH的表达可能会升高，此时就不适合作为内参。
实验验证：在选择内参后，建议进行实验验证，以确认其在具体实验条件下的稳定性和适用性。
5. 其他注意事项
抗体特异性：选择内参抗体时，应确保抗体具有特异性，不会与目标蛋白产生交叉反应。
条带强度控制：在进行Western Blot实验时，应适当控制蛋白上样量和内参的条带强度，避免内参条带过度曝光，影响对目标蛋白条带强度的判读。
常用内参蛋白简介
β-actin：肌动蛋白，细胞骨架蛋白，在各组织和细胞中的表达相对恒定，广泛分布于细胞质内，表达量丰富。
GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，参与糖酵解反应，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，表达量稳定。
β-tubulin：微管蛋白，细胞骨架蛋白，表达通常不会发生改变，也是常用的内参蛋白之一。
