一、实验目的

1.了解灭菌的原理：学习并掌握高压蒸汽灭菌的基本原理和操作方法。

2.掌握高压蒸汽灭菌器的使用方法：通过实际操作，熟悉高压蒸汽灭菌器的操作流程和注意事项。

3.确保实验材料的无菌性：对实验所需的培养基、器械等进行灭菌处理，以保证后续微生物学实验的准确性和可靠性。

二、实验原理

高压蒸汽灭菌的原理是利用密闭的高压锅产生高温饱和蒸汽，通过热力的作用杀灭细菌和其他微生物。当蒸汽压力达到1.05kg/cm²时，水的沸点会升高到121°C。在此温度下持续15到30分钟，可以彻底杀死锅内的各种微生物、孢子或芽孢。

三、实验器材

1.主要仪器：高压蒸汽灭菌锅（如手提式、立式、卧式等）、电炉或煤气炉、量筒、移液管、试管架、三角瓶、培养皿、烧杯、玻棒、培养基分装器、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、麻绳、纱布等。

2.试剂与材料：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水、待灭菌的培养基、实验器械等。

四、实验步骤

1.准备灭菌物品：

将待灭菌的培养基、蒸馏水或其他器皿用牛皮纸或报纸包裹好，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞或造成污染。

三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

2.检查高压蒸汽灭菌锅：

检查水位是否合适，水位线应位于最高水位线和最低水位线之间。

检查排气阀和安全阀是否处于正确位置，确保它们能够正常工作。

3.装载灭菌物品：

将内层灭菌桶取出，向外层锅内加入适量的水。

放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免影响蒸汽流通和灭菌效果。

4.加热灭菌：

加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。

旋紧螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

打开排气阀，用电炉或煤气炉加热，使水沸腾以排除锅内的冷空气。当锅内压力升到所需压力时（如0.103 MPa），控制热源，维持压力至所需时间（如121°C，20分钟）。

5.结束灭菌：

灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气炉，让灭菌锅内温度自然下降。

当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

注意：在压力未降到0时，严禁打开排气阀和锅盖，以防容器内的培养基因内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成污染。

6.检查灭菌效果：

将取出的灭菌培养基放入适宜的温箱中培养一段时间（如24小时），经检查若无杂菌生长，即可待用。

五、实验注意事项

1.确保锅内冷空气完全排除：在加热灭菌前，必须打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。否则，含有空气的蒸汽在同一压力下的温度会低于饱和蒸汽，影响灭菌效果。

2.控制灭菌时间和温度：灭菌时间和温度是影响灭菌效果的关键因素。应根据不同的灭菌物品和实验要求，选择合适的灭菌时间和温度。

3.防止二次污染：在灭菌过程中和灭菌后，应严格防止灭菌物品的二次污染。例如，使用牛皮纸或报纸包裹灭菌物品，避免手直接接触灭菌后的物品等。

4.定期检查灭菌器性能：应定期对高压蒸汽灭菌器进行检查和维护，确保其正常工作。例如，使用专用的细菌测定纸条或熔融温度指示剂来检测灭菌效果。

六、实验应用

高压蒸汽灭菌实验在微生物学、医学、制药、食品等领域具有广泛的应用。例如，在微生物学实验中，需要对培养基、器械等进行灭菌处理；在医疗领域，需要对手术器械、注射器等医疗用品进行灭菌消毒；在制药行业，需要对药品原料、成品和包装材料进行灭菌处理等。