一、mRNA纯化与反转录
1.mRNA纯化：
原理：基于mRNA的3’末端含有多聚腺苷酸（Poly(A)）尾巴结构特性，使用寡聚(dT)（即oligo(dT)）亲和层析法分离纯化mRNA。当总RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，而在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗脱下来。
方法：经过两次oligo(dT)纤维素柱纯化，可获得较纯的mRNA。
2.反转录：
可以选择先用oligo(dT)引物反转录mRNA，再进行cDNA的片段化。这种方法先得到长片段的cDNA，反转成双链cDNA后再进行片段化处理。
或者先将mRNA打断，再结合随机引物进行反转录。mRNA打断的方法包括碱处理法、金属离子（如Mg²⁺、Zn²⁺）溶液处理法、酶（如RNase III）处理法等。
二、mRNA片段化处理
mRNA片段化是构建测序文库的关键步骤之一，主要方法有：
1.酶切法：
使用特定的核酸酶（如DNase I）对mRNA进行酶切，得到片段化的mRNA。这种方法可以控制片段化的程度和均匀性。
2.机械法：
通过物理方法（如超声波处理、喷雾干燥等）将mRNA打断成片段。这种方法操作相对简单，但可能难以精确控制片段化的程度。
在mRNA-Seq等高通量测序实验中，建议采用先对mRNA打断再进行反转录的文库构建方法。因为这种方法获得的测序reads主要是针对基因本体的，而先反转录再片段化的方法可能对转录本3'端具有较强的偏好性。
三、文库构建与纯化
1.文库构建：
将片段化的mRNA进行末端修复、加A尾、连接测序接头等处理，构建测序文库。
2.文库纯化：
使用特定的纯化方法（如磁珠纯化、凝胶电泳纯化等）去除文库构建过程中产生的杂质和副产物，提高文库的质量。
四、测序与数据分析
1.测序：
使用高通量测序仪对文库进行测序，获得大量的测序数据。
2.数据分析：
对测序数据进行质量控制、比对、注释等分析，挖掘基因表达、基因变异等生物学信息。
3.注意事项
mRNA的完整性：在纯化过程中要保持mRNA的完整性，避免过度降解。
片段化程度的控制：片段化处理时要根据实验需求控制mRNA的片段化程度，以获得合适的测序文库。
纯化方法的选择：根据实验规模和需求选择合适的纯化方法，确保文库的质量和测序结果的准确性。
