一、 凯氏定氮法
1.原理：
蛋白质由碳、氢、氧、氮等元素组成，其中氮元素的含量相对恒定，约占蛋白质总量的16%。凯氏定氮法通过测定样品中氮的含量，再乘以蛋白质换算系数（通常为6.25），即可计算出蛋白质的浓度。
2.步骤：
消化：将样品与浓硫酸共热，使含氮有机物分解产生氨。
蒸馏：加入浓氢氧化钠使溶液呈碱性，释放出氨，用硼酸溶液吸收。
滴定：用硫酸或盐酸标准溶液滴定生成的硼酸铵，根据酸的消耗量计算氮的含量。
3.特点：
优点：测量范围广，可用于所有蛋白质分析；操作简单。
缺点：灵敏度较低，不适用于微量蛋白质的测定；操作耗时较长。
二、紫外-可见光谱法（A280测定）
1.原理：
蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基含有共轭双键，能够吸收紫外光，吸收高峰在280nm波长处。蛋白质的浓度与其在280nm处的吸光度成正比。
2.步骤：
准备：将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照。
测定：使用紫外-可见分光光度计在280nm波长处测定吸光度。
计算：根据吸光度和摩尔消光系数计算蛋白质浓度。
3.特点：
优点：操作简单，快速，不消耗样品，测定后能回收样品。
缺点：普适性差，不同蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量不同，可能导致测定误差；易受核酸、嘌呤、嘧啶等物质的干扰。
三、 Bradford蛋白测定法（考马斯亮蓝法）
1.原理：
考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合后，其最大吸收峰位置由465nm变为595nm，溶液颜色由棕黑色变为蓝色。蛋白质与染料的结合量与其浓度成正比，通过测定595nm处的吸光度即可计算蛋白质浓度。
2.步骤：
准备：将考马斯亮蓝G-250溶解在甲醇和盐酸中，制成工作液。
反应：将工作液与蛋白质样品混合，室温放置2-5分钟后，在595nm处测定吸光度。
计算：根据标准曲线计算蛋白质浓度。
3.特点：
优点：灵敏度高，可检测低至微克级别的蛋白质；操作简单，快速，只需加一种试剂。
缺点：染料特异性不高，易受其他物质干扰；不同蛋白质与染料的结合能力不同，可能导致测定结果偏差。
四、 Lowry法（福林-酚试剂法）
1.原理：
在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子结合生成复合物，然后这个复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），产生深蓝色物质（钼蓝和钨蓝的混合物）。蛋白质浓度与蓝色物质的吸光度成正比。
2.步骤：
准备：将样品与碱性铜试剂混合，室温放置10分钟。
反应：加入福林-酚试剂，迅速混合，室温放置30分钟。
测定：在700nm处测定吸光度。
计算：根据标准曲线计算蛋白质浓度。
3.特点：
优点：灵敏度较高，适用于多种类型的蛋白质测定。
缺点：操作复杂，耗时较长，需要精确控制反应时间；颜色深浅随不同蛋白质变化，标准曲线不是严格的直线形式。
五、BCA蛋白测定法
1.原理：
BCA（二喹啉甲酸）法是一种改良的Lowry法。在碱性条件下，蛋白质将铜离子（Cu²⁺）还原为亚铜离子（Cu⁺），Cu⁺与BCA试剂形成紫色复合物，其吸光度在562nm处与蛋白质浓度成正比。
2.步骤：
准备：将BCA试剂A和B按一定比例混合，制成工作液。
反应：将工作液与蛋白质样品混合，在37℃孵育30分钟。
测定：在562nm处测定吸光度。
计算：根据标准曲线计算蛋白质浓度。
3.特点：
优点：灵敏度高，可检测低至微克级别的蛋白质；稳定性好，抗干扰能力强，不受大多数还原剂和去污剂的影响。
缺点：对于含有大量胍盐或高浓度去污剂的样品，可能需要稀释。
六、比浊法
1.原理：
蛋白质溶液具有一定的浊度，其浊度与蛋白质浓度成正比。通过测量溶液中悬浮颗粒对光的散射程度来估计蛋白质浓度。
2.步骤：
准备：将待测蛋白质溶液倒入比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂作空白对照。
测定：使用比浊计或分光光度计在特定波长下测定样品的浊度。
计算：根据标准曲线计算蛋白质浓度。
3.特点：
优点：简单快速，适用于初步筛查蛋白质浓度。
缺点：准确性相对较低，受样品中其他悬浮颗粒的影响。
七、 毛细管电泳法
1.原理：
蛋白质分子在电场作用下会向与其电荷相反的电极移动。不同大小和电荷的蛋白质分子在电场中的迁移速度不同，从而实现分离和定量。
2.步骤：
准备：将蛋白质样品注入毛细管电泳仪中。
电泳：施加电场，使蛋白质分子在毛细管中迁移。
分析：记录电泳图谱，根据迁移时间和峰面积计算蛋白质浓度。
3.特点：
优点：分辨率高，适用于复杂样品中蛋白质的分离和定量。
缺点：设备昂贵，操作复杂，不适用于大批量样品的测定。
八、免疫测定法（如ELISA）
1.原理：
利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶标抗体与蛋白质抗原结合后产生的信号来测定蛋白质浓度。
2.步骤：
包被：将抗原或抗体包被在固相载体上。
加样：加入待测蛋白质样品，与包被的抗原或抗体结合。
加酶标抗体：加入酶标抗体，与结合在固相载体上的蛋白质结合。
显色：加入底物溶液，酶标抗体催化底物显色。
测定：使用酶标仪测定吸光度，根据标准曲线计算蛋白质浓度。
3.特点：
优点：灵敏度高，特异性强，适用于特定蛋白质的定量。
缺点：操作复杂，耗时较长，需要制备高质量的抗体和抗原。
总结
不同的蛋白质浓度测定方法各有优缺点，适用于不同的实验需求。在选择方法时，需要考虑样品的特性、实验条件以及所需的准确性和灵敏度。例如，对于常规蛋白质浓度测定，BCA法因其广泛的适用性和较高的灵敏度，通常是一个安全的选择；对于含有去污剂或还原剂的样品，BCA法也是一个合适的选择；对于纯度较高的蛋白质样品，紫外吸收法因其简单快捷，是一个成本效益高的选择；而对于特定蛋白质的定量测定，免疫测定法则具有更高的特异性和灵敏度。
