凝胶回收是一种用于PCR产物纯化的方法，通过使用溶胶液将琼脂糖凝胶完全溶化。同时结合了一种创新型的离子交换柱，在特定条件下，DNA能够在离心过程中迅速结合到纯化柱上，然后在适当的条件下将DNA充分洗脱出来，实现了对DNA的快速纯化过程。这种方法可以高效地提取纯净的DNA样本，为后续实验提供了可靠的基础
一、实验准备
移液枪，枪头，EP管(2mL或1.5 mL)凝胶成像系统胶回收试剂盒(BIO RAD-Gel Doc XR+)，(Magen HiPureGel Pure DNA Mini Kit /Omega Gel Extraction Kit /FastPure GelDNA Extraction Mini Kit)，小型台式高速离心机(Eppendorf5424/5424R)，恒温混仪(Eppendorfmixer)
二、何时切胶
情况①:PCR 产物出现非特异扩增或双酶切有较大差异的两条片段时，可利用琼脂糖凝胶将目的片段进行分离，并切胶回收目标片段。
Tips:电泳多跑一会儿让条带明显分离。在照胶仪切胶时尽量迅速，防止紫外辐射导致DNA降解或突变。注意防护，避免紫外线触及裸露皮肤和眼睛。切完胶根据胶块大小放置于2mL 的 EP 管中进行称量、溶解。
情况②:PCR 产物片段单一或酶切后有一大一小两个片段(小片段在几十 bp 以内)时，一般可用胶回收试剂盒直接液本回收(至少稀释到 100 微升体积， 高浓度产物可稀释到300 微升再加溶胶液)。
三、试剂盒回收
选择 Magen HiPure Gel Pure DNA Mini Kit(D2111)或Omega Gel Extraction Kit(D2500)试剂盒进行纯化回收。
洗脱时为增加回收产物浓度，一般加15-30 u1ddH,O洗脱即可。
建议流程如下:
1.切胶加入2ml离心管中，加入适量溶胶 Bufer，55℃-65℃溶胶。
Tips:当做液体回收时，直接加入2倍体积的溶胶 Buffer 混合均匀;回收片段较小时还需加入等体积(凝胶或 PCR 体积)的异丙醇以提高回收效率。
2.将溶胶 Bufer 混合液加入过滤柱中，离心过滤,
3.加 300 ml 溶胶 Buffer 在过滤柱中，重复离心，提高回收率。
4.加入 700 ml wash buffer，离心。
5.空转一次，取出过滤柱放入新的1.5ml 离心管中。晾干千后加入适量 ddH20 洗脱。
四、提高回收量
1.增加电泳时的上样量。例如:回收大片段载体，可以酶切2 管 50 微升体系，最后不管多大体积的胶，都用一个柱子回收，以提高回收产物浓度。PCR产物同理。
2.更换新鲜的电泳缓冲液，减少外源DNA污染。
3.切胶时尽量只切有条带的胶，减小额外凝胶体积。胶块太大不容易溶解，而且会导致溶胶液浓度低，影响回收效率。
4.55℃溶胶时间不宜过长或过短，5-10 min 即可,大片段(>5kb)回收溶胶时可加凝胶一倍体积异丙醇，以提高回收效率。
5.溶胶液放凉至室温再过柱可以提高回收效率.
6.加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(>10分钟)或真空干燥 3-5min，使乙醇彻底挥发，时间太短有乙醇残留影响连接效率，干燥时间太久降低回收效 率。
洗脱液提前加热至 50-55℃，洗脱液滴在膜中央，静置 1-2min，以充分洗脱结合在膜上的 DNA，可将洗脱液重新吸取放入膜中央，重复一次，提高回收效率。
五、定量
A260、A280、A230傻傻分不清
回收后的 DNA 片段，可使用超微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000)进行定量，检测时260/280比值在1.8-2.0时纯化效果较好。
Tips :样品 260/280 的比值，代表的是 DNA 和 RNA 样品的纯度。
纯 DNA 的比 值在 1.6-1.9 左右，纯 RNA 的比值在 1.9-2.1左右如果比值偏低，表示样本中存在 蛋白，酚等杂质存在(它们的吸光值在 280 左右)
纯 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值为 2.5 左右。若比值小于 2.0标明样品 被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
六、提高胶回收量的技巧
1.增加电泳时的上样量。
2.电泳缓冲液需新鲜配制。
3.切胶时应只切有条带的胶，避免含有目的片段很少的胶，否则会影响回收率。
4.将切割的胶融化后，无论体积大小，都应使用同一个管子转移到同一个柱子上。
5.溶胶时可以适量增加溶液的使用量，有利于 DNA 与膜的结合，但一般不超过750ul。
6.增加胶回收量的关键在于通过调整柱子溶液的盐浓度、酸碱性和疏水性来使 DNA 与柱子结合。可以在溶胶液中添加10ul PH 5.0的 3mol/L NaAC，以帮助 DNA 分子更好地拦截在膜上。另外，在加热溶解胶后的液体中加入30%异丙醇也有助于提高回收率。
7.在加入洗脱液之前，应将柱子在室温放置约10分钟，使乙醇充分挥发。
8.减少洗脱液用量，一般使用30-50μl洗脱液洗脱，确保洗脱液充分滴在膜中央，以充分洗净结合在膜上的 DNA。
9.可以在洗脱后，进行55度水浴5分钟或50度水浴10分钟以上再次洗脱，或者使用封口膜密封在4度过夜后第二天离心回收，可以提高回收效果。
10.将离心后的洗脱液再次加入吸附柱进行二次离心。
