一、通用刺激方案
1.细胞准备
从小鼠脾脏或其他组织中提取细胞，制备成单细胞悬液。
调整细胞密度至适当范围，一般为 1×106 个/mL。
2.刺激条件
使用特定的刺激剂（如ConA、PMA、Ionomycin等）刺激细胞。
刺激时间根据刺激剂和细胞类型而定，一般为数小时至数天。
3.胞内阻断
在刺激结束前，加入胞内阻断剂（如Brefeldin A、Monensin等）以阻止细胞因子的分泌，使其滞留在细胞内。
阻断时间一般为数小时。
4.细胞固定与破膜
刺激和阻断结束后，对细胞进行固定和破膜处理，以便后续的细胞内染色。
5.细胞内细胞因子染色
使用荧光标记的特异性抗体对细胞内的细胞因子进行染色。
通过流式细胞仪或荧光显微镜等仪器检测染色结果。
二、具体示例
以下是一些针对特定细胞因子的刺激方案示例：
|
细胞因子 |
刺激剂及浓度 |
刺激时间 |
胞内阻断剂 |
|
IFN-γ |
ConA 3μg/mL（2天）/IL-2 20ng/mL+IL-4 20ng/mL（3天） |
2天/3天 |
anti-CD3 10μg/mL（固定）+anti-CD28 2μg/mL（可溶性）+Brefeldin A 10μg/mL（5小时） |
|
IL-4 |
Th2极化条件培养6天 |
- |
PMA 50ng/mL+Ionomycin 1μg/mL+Brefeldin A 10μg/mL（5小时） |
|
IL-5 |
ConA 3μg/mL（2天）/IL-2 20ng/mL+IL-4 20ng/mL（3天） |
2天/3天 |
anti-CD3 10μg/mL（固定）+anti-CD28 2μg/mL（可溶性）+Brefeldin A 10μg/mL（5小时） |
|
IL-10 |
ConA 3μg/mL（2天）/IL-2 20ng/mL+IL-4 20ng/mL（3天） |
2天/3天 |
anti-CD3 10μg/mL（固定）+anti-CD28 2μg/mL（可溶性）+Brefeldin A 10μg/mL（5小时） |
|
IL-17A |
Th17极化条件培养6天 |
- |
PMA 50ng/mL+Ionomycin 1μg/mL+Monensin 10μg/mL（5小时） |
三、注意事项
1.刺激剂的选择：不同的细胞因子对刺激剂的响应不同，因此需要根据实验目的和所需检测的细胞因子类型选择合适的刺激剂。
2.刺激时间和浓度：刺激时间和浓度对细胞因子的产生有显著影响，需要进行优化以获得最佳结果。
3.胞内阻断剂的使用：胞内阻断剂可以阻止细胞因子的分泌，使其滞留在细胞内，从而便于后续的细胞内染色和检测。
4.细胞固定与破膜：在进行细胞内染色前，需要对细胞进行固定和破膜处理，以确保抗体能够进入细胞内与细胞因子结合。
5.染色与检测：使用荧光标记的特异性抗体对细胞内的细胞因子进行染色，并通过流式细胞仪或荧光显微镜等仪器检测染色结果。
请注意，以上刺激方案仅供参考，具体实验条件可能需要根据实际情况进行调整。在进行实验前，建议查阅相关文献或咨询专业人士以获取更详细的信息和指导。
