一、材料准备
1.细胞悬液：按照实验要求的浓度准备细胞悬液。
2.多层培养瓶：确保培养瓶干净且无菌。
3.移液管：根据培养瓶的规格选择合适的移液管（如10ml或25ml）。
4.培养基：预热至适宜温度（通常为37°C）。
二、操作步骤
1.细胞悬液混匀：
将细胞悬液在培养基瓶、培养瓶或其他容器中充分混匀。
2.加液：
用移液管紧贴瓶壁缓慢地将液体加到多层细胞培养瓶中，避免产生泡沫或气泡。
每次加液时，移液管内液体可留少许，以确保加液均匀。
注意事项：10ml移液管可以伸到培养瓶底部使培养基分散开，而25ml移液管则只能伸到特定标志（如NEST标志）的地方把液体分散开。
3.平衡：
把培养瓶有特定标志（如NEST标志）那一侧朝向自己，顺时针做斜45度左右放置一段时间，使瓶中各个隔层的液体达到平衡。
4.水平放置：
轻缓地将培养瓶水平放置于工作台上，有特定标志那一面朝上。
5.晃动培养瓶：
前后左右轻轻晃动多层瓶，使液体均匀地分布在五个生长面上。
注意事项：摇晃的动作要轻柔，一方面是防止起泡沫，另一方面是要防止培养基渗漏到下层中。
三、后续处理
1.培养：
将培养瓶放入适宜的培养环境（如37°C、5%CO2的培养箱）中进行培养。
2.换液：
根据细胞生长情况定期更换培养基。
换液时，可采用抽吸法或倾倒法将旧培养基移除，然后加入新的培养基。
3.消化与传代：
当细胞生长至一定密度时，需要进行消化与传代。
消化时，加入适量的消化液（如胰酶/EDTA），消化一定时间后用消化终止液中和消化液。
采用移液管抽吸法或倾倒法将细胞悬液置于离心管等容器中，进行离心、重悬和传代接种。
四、注意事项
1.无菌操作：整个操作过程需在超净台内进行，确保无菌。
2.细胞密度：加液时要注意细胞密度，避免过密或过稀。
3.避免气泡：加液时要缓慢且紧贴瓶壁，避免产生气泡。
4.平衡时间：平衡时间需根据具体情况而定，确保各隔层液体均匀分布。
5.换液与传代：换液和传代时需轻柔操作，避免对细胞造成损伤。
通过遵循以上指南和注意事项，可以成功地进行贴壁细胞的多层培养瓶培养，提高细胞培养效率和实验成功率。
