一、准备阶段
1.材料准备：
三角培养摇瓶：选择适当规格的三角培养摇瓶，确保其无菌且干净。
培养基：根据细胞类型选择合适的培养基，并预热至适宜温度（通常为37°C）。
细胞株：确保细胞株状态良好，无污染。
其他器材：如无菌吸管、移液器、离心管、显微镜、CO2培养箱等。
2.无菌操作：
在超净工作台内进行所有操作，确保无菌环境。
使用前对三角培养摇瓶、培养基和其他器材进行高压灭菌处理。
二、接种阶段
1.细胞消化与计数：
使用适当的消化液（如胰酶/EDTA）消化细胞，制成单细胞悬液。
使用计数板对细胞进行计数，调整细胞密度至适宜浓度。
2.接种：
将细胞悬液缓慢加入三角培养摇瓶中，避免产生气泡。
接种量应根据细胞类型和培养瓶规格而定，通常建议接种密度为2×104/cm²。
三、培养阶段
1.培养条件设置：
将三角培养摇瓶置于恒温摇床或CO2培养箱中，设置适当的温度（通常为37°C）和湿度条件。
对于需要CO2环境的细胞，应确保CO2浓度适宜（通常为5%）。
2.摇瓶转速与振幅控制：
根据细胞类型和培养需求，设置适当的摇瓶转速和振幅。起始速度一般在75-125RPM之间，视具体情况而调节。
避免剧烈摇晃三角摇瓶，以免影响细胞的生长和繁殖。
3.定期观察与换液：
定期在显微镜下观察细胞生长情况，包括细胞形态、生长密度和有无污染等。
根据细胞生长情况和实验要求，定期更换培养基和补充试剂，以保证细胞的健康生长。
四、收获阶段
1.细胞收获：
当细胞生长至适宜密度或实验要求时，进行细胞收获。
使用适当的消化液消化细胞，制成单细胞悬液。
2.后续处理：
根据实验需求对收获的细胞进行进一步处理，如离心、重悬、计数、冻存或用于后续实验等。
五、注意事项
1.无菌操作：在整个培养过程中，必须严格遵守无菌操作规程，避免细胞污染。
2.细胞密度控制：接种时细胞密度要适度，不可过高或过低。过高的细胞密度会导致细胞生长缓慢或死亡，过低的细胞密度则会影响细胞的贴壁和增殖。
3.培养基选择：选择适合细胞生长的培养基，并根据实验需求添加适当的生长因子和添加剂。
4.培养条件优化：根据细胞类型和培养需求，优化培养条件（如温度、湿度、CO2浓度、摇瓶转速等），以提高细胞生长效率和实验成功率。
5.定期观察与记录：定期观察细胞生长情况，并记录相关数据（如细胞密度、形态变化、培养基pH值等），以便及时发现并处理异常情况。
6.避免剧烈摇晃：在操作过程中要避免剧烈摇晃三角摇瓶，以免影响细胞的生长和繁殖。
7.试剂与器材的清洁与消毒：所有使用的试剂和器材都应提前进行清洁与消毒处理，以确保无菌操作。
通过遵循以上流程和注意事项，可以成功地进行三角培养摇瓶中的细胞培养实验，并为后续的生物学研究提供高质量的细胞样本。
