在活细胞内研究化合物与靶蛋白相互作用，是一个复杂但关键的过程，它对于理解药物的作用机制、优化药物设计以及评估药物效果至关重要。以下是一些常用的方法和技术：

一、NanoBRET™ Target Engagement Assays

1.原理：
NanoBRET™ Target Engagement Assays 是一种在活细胞内研究蛋白与小分子化合物相互作用的检测系统，它基于能量共振转移（BRET）技术。该技术使用NanoLuc®萤光素酶作为能量供体，带有荧光基团618的示踪剂-NanoBRET™ tracer（能量受体）可以透过细胞膜，进入细胞与NanoLuc®-靶点融合蛋白相互作用产生BRET信号。待测化合物与靶蛋白的亲和力通过其与NanoBRET™ tracer的竞争性置换来检测。

2.步骤：

准备细胞：将细胞与NanoLuc®-靶点融合蛋白表达系统结合。

加入示踪剂：向细胞中加入NanoBRET™ tracer。

加入待测化合物：随后加入待测化合物，观察其与靶蛋白的结合情况。

检测信号：检测BRET信号的变化，以此评估待测化合物与靶蛋白的相互作用。

3.应用：
该技术可用于量化细胞内化合物的亲和力或表观Ki，以及部分占有率，评估化合物在细胞内的渗透性，检测化合物在活细胞中的滞留时间，还可用于抑制剂筛选和比较不同化合物的IC50值。

二、表面等离子体共振（SPR）

1.原理：
SPR是一种高灵敏度和实时性检测蛋白质和小分子结合的方法。它将蛋白质或小分子固定在金属表面上，再将另一种分子流入观察区域，分子间相互作用会影响表面等离子体共振的特性，通过测量这些特性的变化来检测分子间相互作用。

2.优点：

灵敏度高，可以在低摩尔浓度下检测分子间相互作用。

实时性，能够实时观察分子间相互作用的动力学过程。

3.缺点：

需要复杂的硬件设备和软件程序。

对非金属表面上的分子不能进行检测。

分子固定可能影响分子间相互作用的特性。

三、 荧光共振能量转移（FRET）

1.原理：
FRET是指一个分子（发荧分子）的荧光能量被另一个分子（接受分子）吸收，从而使发荧分子的荧光强度降低的现象。通过将小分子标记为接受分子，将蛋白质标记为发射分子，可以观察小分子和蛋白质之间的FRET效率变化来确定它们之间的结合情况。

2.优点：

可以在体外或体内进行。

可以研究结合过程的动态变化。

不会干扰分子的结构和功能。

3.缺点：

需要足够精确的定位和定量。

需要在FRET效率变化和结合关系之间建立足够的关联。

四、其他方法

除了上述方法外，还有分子动力学模拟、核磁共振氢解质谱（NMR Spectroscopy）、免疫荧光（IF）、荧光素酶促还原（BERA）、荧光酶联免疫吸附分析（ELISA）、荧光原位杂交（FISH）以及荧光滴定法等，这些方法各有优缺点，适用于不同的研究目的和样品特点。

总结

在活细胞内研究化合物与靶蛋白相互作用是一个综合性的过程，需要根据具体的研究目的和样品特点选择合适的方法。上述介绍的NanoBRET™ Target Engagement Assays、SPR和FRET等方法在这一领域具有广泛的应用和重要的价值。