在Western Blotting（WB）实验中，一张膜要孵育多个抗体时，需要考虑多种因素，包括抗体的来源、特异性、目标蛋白的分子量差异等。
以下是一些建议和步骤：
一、前提条件
1.抗体来源：如果多个抗体来源于同一物种（如都是兔源或都是鼠源），则后续的二抗孵育可能会复杂，因为二抗会与所有一抗结合。理想情况下，应使用不同物种来源的一抗，以便使用不同的二抗进行区分。
2.目标蛋白分子量：如果目标蛋白的分子量相差很大，可以通过分子量标记（MARKER）将膜剪开，分别孵育不同的一抗。
二、操作步骤
1.平行泳道与转膜
在SDS-PAGE电泳时，设置多个平行泳道，每个泳道加载不同的样品或相同样品的不同处理。
转膜时，保留凝胶的上样孔以便后续裁膜。
2.裁膜与一抗孵育
根据上样孔裁膜，每个泳道对应的膜区域用于孵育一个特定的抗体。
将裁好的膜分别放入含有相应一抗的封闭袋或容器中，确保膜与一抗充分接触。
在适当的条件下（如4℃过夜）进行一抗孵育。
3.洗涤与二抗孵育
一抗孵育结束后，用适当的洗涤液（如PBST）洗涤膜以去除未结合的一抗。
接着进行二抗孵育，选择与一抗物种来源相对应的二抗。
在适当的条件下（如37℃孵箱中孵育一定时间）进行二抗孵育。
4.显色与检测
使用适当的显色系统（如ECL）进行显色反应。
使用成像系统（如化学发光成像仪）检测信号并拍照记录结果。
三、特殊情况处理
1.珍贵样本：如果样本非常珍贵且有限，可以考虑在同一张膜上多次使用抗体剥离液处理后再重新封闭和孵育新的抗体。但这种方法可能会影响结果的稳定性和可靠性。
2.同孵多种抗体：虽然理论上可以在同一张膜上同时孵育多种抗体（尤其是当这些抗体的目标蛋白分子量相差很大且没有交叉反应时），但实际操作中并不推荐这样做，因为同孵的效果通常不如分开孵育好。
四、注意事项
确保所有操作都在无菌、无酶污染的环境中进行。
使用高质量的抗体和试剂以获得最佳结果。
严格遵守实验室的安全规定和操作规程。
总之，在Western Blotting实验中一张膜要孵育多个抗体时，应根据实验的具体需求和条件选择最合适的方法和步骤。
