在进行17KD小分子蛋白的Western Blot（WB）实验时，由于小分子蛋白的特殊性，实验过程中需要特别注意一些细节以确保结果的质量。
以下是一次成功实验的经验分享：
一、样品准备与电泳
1.跑胶条件：对于17KD的小分子蛋白，建议跑胶时电压不宜过高，时间不宜过长。一般可以使用80V的电压跑约1小时，且只需要跑到蛋白胶的一半即可。这样可以防止蛋白条带过度弥散。
2.凝胶浓度：选择浓度为15%以上的凝胶，或者梯度胶，以确保小分子蛋白在分离前得到充分的压缩，从而在同一起跑线上开始电泳。
3.加样：确保各泳道的加样量用1x Loading Buffer补齐至同一水平，以减少电泳迁移率的差异。
二、转膜
1.转膜方式：对于小分子蛋白，湿转是较为常用的方法。可以使用80V的电压转膜90分钟。也有建议使用更低的电压和更短的时间，如恒压10V，15分钟或恒流200mA，30分钟，具体可根据实验条件调整。
2.转膜膜的选择：对于17KD以下的小分子蛋白，建议使用0.22μm的PVDF膜，因为0.45μm的膜可能会导致小分子蛋白穿透。如果穿透严重，可以叠加使用两张0.22μm的膜。
3.转膜后处理：转膜完成后，用TBST清洗一遍，以去除多余的转膜液。
三、封闭与抗体孵育
1.封闭：使用5%脱脂奶粉封闭1小时，或根据实验需要调整封闭时间和封闭液。
2.一抗孵育：按照说明书推荐的配比稀释一抗，通常需要在4℃条件下过夜孵育。
3.洗膜：一抗孵育后，用TBST洗涤3次，每次5-10分钟，以去除未结合的一抗。
4.二抗孵育：用TBST按比例稀释二抗，室温孵育1-2小时。
5.再次洗膜：二抗孵育后，再次用TBST洗涤3次，每次10分钟，以确保去除未结合的二抗。
四、发光与曝光
1.发光液：在暗室中加入适量的发光液，确保膜完全覆盖。
2.曝光：根据发光强度选择合适的曝光时间。对于小分子蛋白，由于其信号可能较弱，可能需要较长的曝光时间或使用更灵敏的曝光设备。
五、注意事项
1.温度控制：电泳和转膜过程中注意控制温度，避免高温导致分子运动加快，加剧弥散现象。
2.抗体选择：确保一抗和二抗的特异性，避免非特异性结合导致的背景信号过高。
3.实验记录：详细记录实验过程中的每一步操作，以便在出现问题时进行回顾和分析。
通过以上步骤和注意事项，可以提高17KD小分子蛋白WB实验的成功率，获得清晰、准确的结果。
