2025/1/7 14:00:00

分子生物学实验中,常用试剂的配制是实验成功的基础。以下是一些常用试剂的配制方法:

一、电泳类试剂

1.50×TAE(Tris-乙酸)缓冲液(pH=8.5)

配制方法:准确称量各物质,以确保缓冲液处于最佳状态。注意,不要使用实验室已配制的Tris缓冲液来配制2mol/L Tris碱,因为实验室常见的Tris缓冲液往往使用了HCl调节了pH,成为了Tris-HCl缓冲液,而此处是使用纯Tris来配制Tris-乙酸缓冲液。

 

2.TBE溶液

注意事项:TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5倍的溶液,使用0.5倍的稀释液。在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中它们分别与1kb、0.6kb、0.15kb的双链DNA片断的泳动率大致相同。

二、培养基类

1.LB培养基

配制方法:将胰蛋白胨、酵母提取粉等组分溶解在0.9L水中,如需要用4M NaOH调整pH至7.0,再补足水至1L。然后分装于250mL锥形瓶并用泡沫或棉塞或封口膜进行封口,121℃灭菌15~20min。在液体培养基的基础上,加入7g琼脂粉并煮沸,调节pH后定容至1L。

注意事项:胰蛋白胨和酵母提取粉易粘连称量纸,故称量完成后将称量纸与药品一起放到去离子水中,然后在加热过程中将称量纸上的药品清洗干净取出;用双层封口膜封口灭菌;只要培养基保持澄清状态,可认为是无菌的,可以继续使用。

2.MS培养基

注意事项:某些试剂(如阴影的两种试剂)需要单独配制成高浓度的溶液(如200×),否则大量元素容易形成沉淀;抗生素溶液的配置一般用无菌水或醇类充当溶剂;以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理,用无菌水配的用0.45或0.22μm无菌过滤器过滤除菌;所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存,也可用锡箔纸包裹;镁离子是四环素的拮抗剂,四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基(如LB培养基);抗生素配制出以后4℃可保存3个月,-20℃可保存一年;配制完成后注意分装。

 

三、核酸提取类

1.10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液

配制方法:在90mL无菌水中溶解10g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分装备用。

注意事项:SDS的微细晶粒易扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS;10%SDS溶液无须灭菌(高温条件下分解会产生CO等有毒气体);若有沉淀形成,可以适当水浴加热溶解后继续使用。

2.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水

配制方法:加1mL DEPC于999mL水中,用磁力搅拌器在37℃条件下搅拌4h以上,静置过夜,在121℃条件下高温灭菌20min,以使残余的DEPC失活。

注意事项:DEPC具有强烈的致癌性,故操作时必须戴双层口罩、双层手套,并在通风厨中进行;此配制的DEPC水用于RNA提取中70%乙醇的配制及RNA的溶解。

3.CTAB法提取植物DNA的萃取液

配制方法:在100ml的容量瓶中,依次加入2g CTAB粉剂、10ml 1M Tris(pH8.0)、4ml 0.5M EDTA(pH8.0)、28ml 5M NaCl、1g PVP和1ml β-巯基乙醇,然后用双蒸水定容至100ml。另外,还需要配制由苯酚、氯仿、异戊醇按不同体积比(如25:24:1或氯仿、异戊醇按24:1)混合而成的抽提液。

 

四、其他试剂

DNA测序技术中的试剂

1.储备液:由95g丙烯酰胺和5g甲叉双丙烯酰胺配制而成,浓度为38%W/V和2%W/V,溶于140ml双蒸水后定容至250ml。过滤后存放在4℃棕色瓶中,可保存两周。

2.10%过硫酸铵溶液:0.5g过硫酸铵溶于4ml水中,再加水定容至5ml,建议每次使用前新配制。

3.10×TBE缓冲液:含有1mol/L Tris、0.83mol/L硼酸和10mmol/L EDTA,调配比例为121.1g Tris、51.35g硼酸和3.72g Na2EDTA·2H2O,用双蒸水定容至1升,可在4℃保存两周,pH约为8.3。

4.固定/停止溶液:10%冰醋酸溶液,调配2升以备后续固定或停止反应。

5.染色溶液:硝酸银和甲醛混合后,溶于超纯水,用于样本染色。

6.显影溶液:60g碳酸钠溶解在2升超纯水中,使用前需添加3ml 37%甲醛和40ml硫代硫酸钠(10mg/ml)溶液。

 

此外,在RNA提取实验中,还会使用到氯仿、异丙醇、75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)等试剂。在配制和使用这些试剂时,需要严格遵守实验室安全规范,确保实验人员的安全和实验结果的准确性。

总的来说,分子生物学常用试剂的配制需要根据实验的具体需求来选择和配制相应的试剂。在配制过程中,需要严格控制试剂的质量和浓度,以确保实验结果的准确性和可靠性。同时,也需要注意实验室安全和环境保护,避免对实验人员和环境造成危害。

 

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