提取总蛋白是一个关键的实验步骤，特别是在生物化学、分子生物学和细胞生物学等领域的研究中。以下是提取总蛋白时需要注意的六个关键点：
1. 样本准备与处理
样本选择：确保样本新鲜，避免使用已经变性或降解的样本。
清洗步骤：在提取前，用适当的洗涤液（如PBS、TBS等）清洗样本，以去除杂质和干扰物质。
样本保存：若不能立即提取，应将样本妥善保存在低温条件下（-80℃或-20℃），以减少蛋白质降解。
2. 裂解液的选择与配制
裂解液成分：选择适当的裂解液，其主要成分应包括缓冲体系、盐离子、离液剂等。缓冲体系应维持近似生理pH值（如7.4），以避免蛋白质变性。盐离子浓度通常选择生理盐浓度（如150mM NaCl），但根据具体需要也可调整。
抑制剂的加入：为防止蛋白质降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制剂（如PMSF、蛋白酶抑制剂混合物等）。若需检测磷酸化蛋白，还应加入磷酸酶抑制剂。
裂解液体积：根据样本量适当加入裂解液，确保充分裂解。
3. 裂解条件
温度控制：在低温条件下（如4℃）进行裂解，以减慢蛋白质降解速度。
裂解时间：根据样本类型和裂解液效果确定裂解时间，通常为15-30分钟。
物理辅助：对于难以裂解的样本，可采用超声破碎、匀浆等方法辅助裂解。但需注意超声处理时功率和时长的选择，以避免破坏蛋白质结构。
4. 离心与收集
离心条件：在适当温度下（如4℃）进行高速离心，以分离出上清液中的蛋白质。
上清液收集：小心吸取上清液，避免吸入沉淀物。
5. 蛋白质变性
变性剂选择：常用的变性剂有SDS、LDS等，它们能破坏蛋白质的空间结构，使其变性展开。
变性条件：加入适量的变性剂和上样缓冲液后，在高温条件下（如100℃）加热一定时间（如10分钟），使蛋白质充分变性。
6. 蛋白质保存与检测
保存条件：变性后的蛋白质可保存在低温条件下（-80℃或-20℃），长期保存时需避免反复冻融。
质量检测：可采用BCA法、Bradford法等检测蛋白质浓度，确保提取效率和质量。同时，可通过SDS-PAGE电泳等方法检测蛋白质的分子量分布和纯度。
综上所述，提取总蛋白时需要注意样本准备与处理、裂解液的选择与配制、裂解条件、离心与收集、蛋白质变性以及蛋白质保存与检测等关键点。遵循这些注意事项可以确保提取到高质量的总蛋白，为后续的实验研究提供可靠的基础。
