2024/12/30 16:24:00

首先要确定提取的是组织蛋白还是细胞蛋白?

细胞蛋白的提取方法:

(不同细胞类型的蛋白或细胞不同部位的蛋白提取方法或有不同)全蛋白提取试剂盒 一般是取100 mg 标本 + 1 ml lysis buffer + 10 ul 磷酸酶抑制剂 + 10ul PMSF + 1 ul 蛋白酶抑制剂 放入研磨器研磨,直至研磨成匀浆(注意冰上操作,有的试剂盒说明在研磨时加液氮),倒入EP管,放入离心机离心,12,000 g / 5 min,取上清保存备用

另一种提蛋白试剂,用RIPA buffer (Gibco) + 1% cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor (Sigma)

20mg样品(尽量吸尽PBS) + 150 ul RIPA 溶液

冰上放置5~30min(赶时间可短)

 

蛋白定量-BCA测定方法

(如果不同样品总蛋白表达量以及蛋白组分差异大,总蛋白调齐之后还需要看内参蛋白的表达是否一致,最后可根据内参蛋白调整上样量

BSA标准品一般需用PBS稀释液稀释(按照protocol来)。释待测样品至合适浓度,使样品稀释液(稀释后浓度一般不超过测得标准品的最高浓度),总体积为20 μL。据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B ( 50:1 ) 配制适量BCA工作液,充分混匀,每孔加入200 μL BCA工作液。

37℃放置30分钟(可调整时间)后,以标准曲线0号管做参比,在562 nm波长下比色,记录吸光值。以蛋白浓度 ( μg/ul )为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。

绘制标准曲线 y = 0.554x+0.0034

据所测样品的吸光值(此处为y值)Average of triplicate, 代入y = 0.554x+0.0034 得到蛋白浓度x值,乘以稀释倍数。

根据蛋白上样量确定体积(如上样总体积16ul (加 混匀的4x Laemmli+β-巯基乙醇 煮沸变性),上样量20ug,测得蛋白浓度5ug/ul,则取蛋白提取液体积 volume = 20/5 = 4ul),补PBS 8ul,再加4x Laemmli 4ul, 使上样体积相等。

一般99℃水浴变性5min(变性可尝试不同时间,如3min、7min或更长),保存于-80℃。

加入5x loading buffer (即80ul 样本 加 20ul loading buffer ),摇匀,可用封口膜封口 (防止煮沸时EP管口因压力高而弹开) 煮沸变性(温度时间根据蛋白可做相应调整)。

 

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