细胞活性通常是指细胞维持或恢复自身代谢、增殖等生理活动的能力。通过检测细胞活性可知晓细胞状态、分析细胞毒性、比较增殖能力或进行活细胞计数等，是一项常用的细胞生物学检测手段。由于细胞活性一定程度上可由细胞生理活动强度指示，因此对细胞活性的检测往往也是对细胞生理活动能力的检测，例如检测活细胞固有的还原力、细胞膜完整性、酶功能、膜/氧化还原电位、细胞增殖能力和线粒体功能等。
比色法便是利用活细胞还原力，尤其是线粒体中脱氢酶，将底物还原后检测吸光值的改变来衡量活细胞还原力。在对细胞还原力的检测中，培养液中若存在还原酶类，例如谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST），可能会使测定结果偏离,真实水平偏高。目前应用的底物以刃天青盐类和四唑盐类为主，在四唑盐类的底物中尤其以灵敏度高、重复性好、毒性极低的CCK-8最受欢迎。下面起比较一下这两类底物的优缺点吧！
刃天青（resazurin）
刃天青溶液呈蓝色，通常用作酸碱指示剂（pH3.8橙～6.5深紫）和氧化还原指示剂。在进行细胞活性检测时，刃天青可渗入细胞并被活细胞不可逆地还原为粉红色，同时有红色荧光的试卤灵（resorufin）出现（图1）。试卤灵的吸光值或荧光强度与细胞数量、还原能力呈正相关，因此可通过任一参数来评估细胞活性。试卤灵具有细胞膜渗透性，细胞可在反复润洗后继续培养。
图1 刃天青显色原理图
刃天青检测试剂较为便宜且应用范围很广，哺乳动物细胞、细菌、植物和真菌类均有报导，此外也常用于牛奶或废水微生物检测。由于试卤灵具有荧光，因此刃天青检测更加灵敏，但也易受培养液或细胞代谢物的荧光干扰，此外还会被培养液中的FBS或BSA淬灭。同时作为优秀的电子载体，长时间处理细胞可能会由于过量消耗细胞中NADH而产生细胞毒性。因此在实际使用中需要设立完整的对照组，选择合适的试剂浓度和反应时间。
试卤灵的荧光激发波长为530–570 nm（激发峰为570 nm），发射波长为580–610 nm（发射峰为585 nm）；吸光值在570 nm有最大值。
四唑盐（tetrazolium salts）
四唑盐（表1）是一种人工合成的杂环化合物，它可被活细胞还原生成甲臜（Formazan），不同的四唑盐衍生物作底物会得到不同颜色的甲臜，与试卤灵一样，甲臜的吸光值大小与细胞数量、代谢活性呈正相关，并以此作为细胞活性强弱的指标（图2）。
图2 四唑盐显色原理
表1 四唑盐的类型
经典四唑盐
MTT是一种带正电四唑盐，其水溶液呈黄色，可顺膜电势进入活细胞并被线粒体中脱氢酶还原为紫色不溶甲臜，在经过洗涤、裂解细胞，并用DMSO溶解后可在570 nm检测吸光值。由于生成的甲臜会堆积在细胞中，因此可在显微镜下进行单细胞观察，经过洗涤后检测吸光值也可以有效排除背景干扰，加上其相对较高的灵敏度和低廉的价格，作为较早用于细胞活性检测的四唑盐至今仍有使用（图3），但是MTT经还原所产生的甲臜不溶于水，需被溶解后才能检测，对实验结果的准确性产生影响，同时不太适合悬浮细胞活性检测。
图3 MTT显色原理
水溶性四唑盐
虽然还原MTT生成的甲臜不溶并堆积在细胞中利于单细胞观察，但细胞会被完全破坏，不可重复，用于溶解甲臜的有机溶剂会对实验人员有危害。
然而通过在苯基中引入电荷、羧基基团或磺酸基而开发的四唑盐，增大了底物以及产物甲臜的溶解性从而解决了上述问题。其中XTT、MTS和WST等四唑盐由于负电性增大不能进入细胞，需要借助电子偶联载体，例如吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）将细胞内还原力输送到膜外完成还原反应。这也同时降低了细胞毒性，增大了可重复性，试验完成后细胞可继续培养。PMS高效的传递电子能力也使得反应速度加快，检测更加灵敏。
XTT和MTS
XTT是第一个改良的四唑盐，还原生成的甲臜为橙黄色，在450 nm 处有最大吸光值，虽然溶解性优于MTT，反应完成后可直接检测，但试剂稳定性差，底物和PMS分装2管，现用现配，不易保存。
MTS还原生成的甲臜为棕黄色，颜色较深，易于检测，最大吸光值位于490 nm处，相较XTT稳定性大大提升，底物和PMS预混直接添加，反应完成后直接检测。但是在MTS使用中有报道称培养液中的脂肪酸和血清中的蛋白可能会影响检测结果（图4）。
图4 MTS显色原理
WSTs（water-soluble tetrazolium salts）
WSTs是一系列溶解度更高的四唑盐，它们具有相似的原理和特性，但生成的甲臜具有不同颜色，有不同的吸收光谱（图5）。
图5 WSTs显色原理
以CCK-8（WST-8）为例，生成的橙黄色甲臜在450 nm处有最大吸光值；在性能上，相较XTT和MTS，CCK-8检测具有更高的灵敏度和线性范围，试剂及生成甲臜的水溶性和稳定性也有很大提升，重复性更好；在稳定性上，CCK-8和电子偶联试剂预混，不需要预制，反应完成后可直接检测，且可以稳定保存24 h；此外对细胞毒性很低，检测完成后细胞可继续培养。因此CCK-8是进行细胞活性检测中各项性能最佳的四唑盐，完全是不靠颜值而凭实力取胜的选手哦。
其他四唑盐衍生物
此外还有一些四唑盐也在使用，例如在细胞外直接反应的INT，常用于检测细胞外泄的乳酸脱氢酶，生成紫红色不溶甲臜；在细胞内直接反应的TTC，常用于检测种子和根系活性，生成红色水溶甲臜；在细胞内直接反应的NBT，用于检测组织学检测，生成蓝黑色不溶的甲臜。
