明明小鼠血液已经凝固，离心后获得的血清却不够清澈，部分带有少许淡红色？是离心导致溶血了吗？

或者制备血清的质量不一致，时好时坏影响实验结果，怎么办？

 

一、动物实验难免需要制备小鼠血清

主要是为了获得血清里的蛋白质等生物大分子，如抗体、酶、激素等，

从而比较实验组与对照组之间相应指标的差异。

 

在生命科学研究里，

血清多数是用于ELisa实验，

我们买的那些试剂盒，

包括测肝酶、肌酐、某些激素成分的，

一般都是Elisa的原理。

 

本身动物实验个体差异大（对比细胞实验），实验结果也相应会出现较大差异。

 

如果血清制备的水准又不稳定，

时而清澈透明（带淡黄，但C57小鼠并不明显），时而混有淡红色，

这样无疑是又增加了实验结果误差。

 

二、为什么这里强调小鼠血清？

因为大、小鼠虽然血清制备的方法是一样的，但由于小鼠血液量少，相应血清就少，容易出现制备的血清带有淡红色的结果。

这是由于血清含量较少，且离心参数不大，沉淀物不致密，操作过程难免误吸了少许沉淀物，从而导致血清带有淡淡的红色。

 

这些少许沉淀物对Elisa结果有影响吗？

有。此时血清中混有红细胞。

当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，Elisa的反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。

 

三、如何稳定制备漂亮的小鼠血清呢？

以下步骤是经过实验室长期实践验证过的方法，仅供参考：

1.常规小鼠摘眼球取血法取血

①麻醉（不麻醉会导致小鼠乱动，且不太符合伦理）；

②剪胡须：用干燥的剪刀剪去小鼠双侧胡须（血液碰到胡须异物，会发生溶血，原理是提前激活了外源性凝血途径，且此时血液尚未静止还处于流动中）（剪双侧胡须的原因是有时候单侧摘眼球偶有失败的时候，眼球后组织没有拔出，导致血液流不出来，此时可以迅速摘除另一眼球，避免实验失败，因此剪去双侧胡须很有必要）；

③摘眼球：用镊子摘除小鼠眼球；

④接血：提前做好标记的无菌EP管悬空接取滴落的血液，一般20g小鼠接取12~14滴血就差不多没了，没必要为了最后那一两滴等很久 ，迅速安稳静置EP管才是最主要的。

⑤室温静置1小时充分凝固：我们的无菌EP管里是没有任何抗凝剂的，一般室温静置30min左右就会充分凝固，保险起见我们一般是室温静置1小时。

不推荐4℃静置过夜！很多实验室的方法是4℃静置过夜，红细胞也会发生热胀热缩，4℃下放久了容易破坏红细胞原有生理形态，更容易导致溶血，且过夜时间太久，容易对某些激素成分或者糖分产生影响，能1小时后制备，就尽量不要过夜！

 

 

2.4℃ 3000~4000rpm 离心20min

静置1小时后血液充分凝固，可以看到因为血凝块收缩而析出的少许血清。此时按方法操作的话，这个小鼠血清已经不存在溶血的情况了。其实出现溶血的原因绝大多数是出现在上述步骤一采血的环节，而不是后续的离心环节。

不过这个步骤离心转速也不宜过大，过大也确实会溶血，一般4000rpm左右不会有任何问题。

 

血清里出现溶血现象一般离心前就可以发现

 

3.吸上层血清120μL到新的无菌EP管离心完毕后，会发现EP管内分层更明显了，上层无色至微微淡黄的澄清液体就是血清，一般人、牛等大动物的血清淡黄色更明显，小鼠的血清淡黄色并不明显（C57小鼠为例）。

为什么这步强调吸120μL呢？因为一只20g小鼠的眼球取血可以顺利获得12~14滴左右，再多就要多等待、刺激或改变小鼠体位等操作，容易出现血样本溶血，不值当。因此这12滴左右的血液静置1小时凝固、离心后，一般可以获得200μL左右的血清，但你要完全吸干这200μL血清的话，容易误吸许多血凝块，原因不是操作问题，而是因为4000转左右的离心参数下，血凝块并不牢固，稍有点吸力就会跑。而Elisa实验，一般一个样三个复孔50μL就够用了，因此我们在这步吸120μL足够了。至此，其实血清已经制备好了。但是实践操作会发现，尽管我们只吸了120μL的血清，每个EP管里的血清颜色仍然不太一样，不是淡黄程度不同，而是有些还是带有少许淡红色（此时 一般不是溶血导致，而是误吸了血凝块）。

因此最好不要怕麻烦，多花十几分钟做第四、五步：

4.2次离心，4℃ 8000rpm 3~5分钟二次离心的不是血凝块，吸完血清的血凝块在第三步的时候就可以扔掉了，二次离心的是120μL的血清EP管。此时基本不含多少红细胞，8000rpm不会发生溶血，且这个参数5分钟完全不用担心将蛋白质离心下来。

5.吸上层血清100μL到新的无菌EP管经过二次离心后，你会发现刚刚那些带有很淡红色的EP管底部，确实出现一个红点（残留血凝块）。此时吸上清的时候，统一吸100μL就够用了，有的样本多有的样本少也没有太大意义。最后，我们就能得到非常干净、清澈透明程度基本一致的优质血清，每只小鼠最终获得100μL，足够用了。血清标本可在2～8℃下保存1周。如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃或者-80℃保存。冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。一般建议直接放-20℃保存，安排好实验的时候，Elisa之前试剂盒需要复温，此时血清也一起复温。

 

四、 总结：

1.采血12~14滴，室温静置1小时凝固；

2.离心：4℃ 3000~4000rpm 20min；

3.吸上层血清120μL至新EP管；

4.2次离心：4℃ 8000rpm 3~5min；

5.吸上层血清100μL至新EP管；

3.-20℃保存备用。

 

整个过程也就2小时左右。