一、实验目的：

PCR产物的连接和克隆。

二、实验原理：

T载体是两侧的3’端添加了“T”的线性化载体，因为大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用T载体可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

T载体包含LacZ基因，通过表达β-半乳糖苷酶，在含有IPTG，X-gal的平板培养基上，可进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆。大多数T载体提供氨苄青霉素两种筛选标记，有的T载体提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。

三、实验试剂：

1. T载体试剂盒

2. PCR回收产物

3. ddH2O

4. 感受态细胞

5. LB培养基

固体培养基：10 g/L NaCl, 10 g/L 蛋白胨, 5 g/L 酵母提取物, 15 g/L 琼脂粉

液体培养基：10 g/L NaCl, 10 g/L 蛋白胨, 5g/L 酵母提取物

6. 氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）

储存液：100 mg/ml

工作液：100 μg/ml

7. 异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG）

储存液：100mM

工作液：0.5mM

8. 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside , X-Gal）

储存液：20 mg/ml

工作液：200μl/ 100ml LB 培养基或者50μl / 9cm平板

四、实验步骤：

1. 在微量离心管中配置下列反应体系并混匀：

1μl T载体（50μg）摩尔数约为0.03 pmol。

PCR产物的使用量（ng）=nmol x 660 x bp数

2. 在PCR仪中16℃反应30min。

室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。>2Kb的PCR产物连接时，需延长至1h。

3. 取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中（一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl），置于冰浴中。

4. 向感受态细胞悬液中加入连接产物（DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一；为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰中放置30min。

5. 将离心管置于42℃水浴锅中放置90sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2 min，该过程不要摇动离心管。

6. 向每个离心管中加入500μl不含抗生素LB 培养基，混匀后37℃振荡培养（150 rpm），摇床振荡培养45-60min，使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

7. 取适量菌液（连接产物的转化菌液建议离心重悬于200μl LB液体培养基，取100μl用于涂布；保留剩余的菌液于4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留）加到含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基平板上，用细菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。

8. 平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养12-16h。

9. 挑选白色菌落进行鉴定。

五、注意事项

1. PCR产物最好切胶回收，以免杂质影响克隆效率。

2. Solution Ⅰ需要在冰中溶解，并避免反复冻融。

3. 感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。

4. 最好使用新鲜配置的培养基。