一、概况

实时荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种用于实时监测PCR反应进度的技术。同时，可以定量相对少量的PCR产物（DNA、cDNA 或 RNA）。qPCR基于对报告分子产生的荧光的检测，随着反应的进行，报告分子产生的荧光会增加。
qPCR也称为Real-Time PCR，但需要注意的是，Real-Time PCR不应该被缩写成RT-PCR，RT-PCR指代的是反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）。

                                              部分PCR术语英文与缩写对照

二、qPCR的原理和步骤

qPCR也采用了相同的PCR扩增原理。但是，不是在反应结束时查看凝胶上的条带，而是“实时”监测该过程。将反应放入实时PCR机器中，该机器用相机或检测器观察反应的发生。尽管使用了许多不同的技术来监测PCR反应的进度，但所有技术都有一个共同点。它们都将 DNA 的扩增与荧光的产生联系起来，在每个PCR循环中都可以用相机简单地检测到荧光。因此，随着反应过程中基因拷贝数的增加，荧光也会增加，表明反应的进行。

qPCR工作流程工作过程可分为两个步骤：
A. 扩增
1.变性高温孵育用于将双链DNA“熔解”成单链，并松散单链DNA中的二级结构。通常使用DNA聚合酶可以承受的最高温度（通常为95°C）。如果模板GC含量高，则可以增加变性时间。
2.退火在退火过程中，互补序列有机会杂交，因此使用基于计算出的引物熔解温度（Tm）（比引物的Tm低5°C）的适当温度。
3.延伸在70-72°C时，DNA聚合酶的活性最佳，引物延伸以高达每秒100个碱基的速度发生。当实时 PCR 中的扩增子较小时，此步骤通常与使用60°C作为温度的退火步骤相结合。
B. 检测
该检测基于荧光技术。

1.首先将样本保存在适当的孔中，并像正常PCR一样进行热循环。

2.在实时PCR中，该机器受到钨或卤素源的影响，导致添加到样品中的标记物发出荧光，并且信号通过样品 DNA 拷贝数的扩增而被放大。

3.信号由检测器检测到，并在转换为屏幕上显示的数字信号后发送到计算机。

4.号达到阈值电平（探测器的最低检测电平）时，可以检测到信号。

三、qPCR中使用的荧光标记物

                              使用SYBR Green和Taqman 探针两种方式的qPCR原理

1.Taqman 探针
它是一种水解探针，带有报告染料，通常在其5'端带有荧光素 （FAM） 和连接到寡核苷酸 3' 端的淬灭基团四甲基罗丹明（TAMRA）。在正常条件下，探针保持盘绕在自身上，使荧光染料靠近淬灭剂，从而抑制或淬灭染料的荧光信号。Taq聚合酶的寡核苷酸与靶基因具有同源区域，因此当靶序列存在于混合物中时，它与样品DNA 结合。当Taq聚合酶在延伸阶段开始使新的DNA链变短时，它会导致探针被5'末端核酸酶活性降解，荧光素与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。随着此过程的继续，在每个循环中信号分子的数量增加，导致荧光的增加，这与靶标的扩增呈正相关。

2.SYBR Green
这是一种染料，当它在DNA的小沟处非特异性结合时，会发出突出的荧光信号。也可以使用其他荧光染料，如溴化乙锭或吖啶橙，但SYBR Green更适合使用，因为它的信号强度更高。SYBR Green比Taqman探针更受欢迎，因为它可以提供有关每个扩增循环的信息以及无法从 Taqman探针获得的熔解温度信息。然而，与Taqman探针相比，它的缺点是缺乏特异性。

四、实时荧光定量PCR的优势

与普通PCR相比，它具有许多优点：

1.它对反应进行了观察，这有助于确定哪些反应效果很好，哪些反应失败了。

2.可以精确计算反应的效率。

3.反应后无需在凝胶上运行PCR产物，因为熔解曲线分析可以达到目的。

4.实时荧光定量PCR数据可用于对基因表达进行真正的定量分析。相比之下，老式PCR充其量只是半定量的。

5.比普通PCR更快。样品定量的复杂性较低等。

因此，与普通的制备型PCR不同，实时荧光定量PCR允许在几个循环后自动确定多个PCR反应的成功，无需对每个反应进行单独分析，避免了“假阴性”的问题。

五、qPCR的应用

 qPRC可应用于基因表达分析（癌症研究、药物研究）、疾病诊断和管理（病毒定量）食品检测（转基因食品）和动植物育种（基因拷贝数）等多个方面，可以说其应用场景非常广阔。