不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。

碳水化合物的代谢试验

原理：由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验方法有：

①糖类发酵试验，是鉴定细菌最常用的生化反应，特别是对肠杆菌的鉴定尤为重要；

②葡萄糖代谢类型鉴别试验；

③七叶苷水解试验；

④淀粉水解试验；

⑤甲基红试验；

⑥V-P试验；

⑦β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）。

1.糖（醇、苷）类发酵试验

由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同。细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。

将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中，置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应保持湿度，以免培养基干燥。若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。

若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。它是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
2.氧化-发酵实验（O/F试验） 

细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型，氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。

利用此试验可区分细菌的代谢类型。将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于 1cm。将培养基于35℃培养48h或更长。两支培养基均无变化为不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型，若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。

主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。

3. β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

从培养基上取菌，于0.25ml 无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37°C水浴 5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴 20min~3h 观察结果。菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20~30min 内显色。迅速及迟缓分解乳糖的细菌 ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。

4.七叶苷水解试验

将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。

5. 甲基红试验

将待检菌接种于上述培养基中，培养2~4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。

6. V-P 试验

将待检菌接种于上述培养基中，于35°C培养48h 后加入甲液（6% α-萘酚酒精溶液）和乙液（40% KOH 溶液），振摇。在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35°C 4h后仍如故者即为阴性。本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者为阳性的细菌，后者通常为阴性。

 

蛋白质和氨基酸的代谢试验

原理：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋自质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。具体试验方法有：

①明胶液化试验；

②吲哚试验（靛基质试验）；

③硫化氢试验；

④尿素酶试验；

⑤苯丙氨酸脱氨酶试验；

⑥氨基酸脱羧酶试验。

1. 明胶液化试验

将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22°C培养7d，逐日观察结果。若用35°C孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4°C冰箱内30min，再看结果。培养基呈液化状态为阳性。

肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。

2. 吲哚（靛基质）试验

某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。将待检菌接种于上述培养基中，于35°C培养24~48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

3. 硫化氢试验

某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35°C培养24~48h 观察结果。培养基变黑为阳性，不变为阴性。主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。

4.尿素分解试验

将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养18~24h观察结果。培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性，另外笛氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。

5.苯丙氨酸脱氨酶试验

将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35°C培养18~24h，滴加10%三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下。出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时间会引起褪色。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。

6.氨基酸脱羧酶试验

将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加人无菌液体石蜡或矿物油，于35°C培养1～4d，每日观察结果。对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均阴性。

 

碳源和氮源利用试验

是细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验。在枸橼酸盐培养基中，细菌只有利用枸橼酸盐作为碳源，分解后生成碳酸钠使培养基变碱性，PH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深蓝色。常用的试验方法有枸橼酸盐利用试验、丙二酸盐利用试验。

1.枸橼酸盐利用试验

将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35°C培养1～4d，每日观察结果。培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基则不变色，为阴性。用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。

2.丙二酸盐利用试验

将被检菌接种于上述培养基，35℃培养24～48h后观察结果。培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性。颜色无变化为阴性。用于肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。