一、试剂准备

①包被缓冲液：使用pH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲液进行包被。具体配制方法为：溶解1.59克Na2CO3和2.93克NaHCO3于蒸馏水中，定容至1000毫升。
②洗涤缓冲液（pH 7.4 PBST）： 配制所需的PBST缓冲液成分为：0.2克KH2PO4、2.9克Na2HPO4·12H2O、8.0克NaCl和0.2克KCl，加入0.5毫升Tween-20后，用蒸馏水稀释至1000毫升。
③封闭液/稀释液： 可通过添加0.1克牛血清白蛋白（BSA）到100毫升洗涤缓冲液中或5克脱脂奶粉到100毫升的洗涤缓冲液内进行制备，以用于封闭或稀释。
④终止液： 使用2M H2SO4作为反应终止液。配制方法是将178.3毫升蒸馏水慢慢地滴加21.7毫升浓硫酸（98%），注意需在通风橱进行以保证安全。
⑤底物缓冲液（pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液）： 配制25.7毫升的0.2M Na2HPO4（28.4克/升）和24.3毫升的0.1M柠檬酸（19.2克/升），再加入50毫升的蒸馏水混合。
⑥TMB（四甲基联苯胺）使用液： 混合0.5毫升TMB溶液（10毫克/5毫升无水乙醇）、10毫升的底物缓冲液（pH 5.5）和32微升的0.75% H2O2以备使用。
⑦抗原、抗体及酶标记抗体： 按照实验需求准备并稀释，确保浓度合适并使用前充分混匀。
⑧待测样品及抗原标准样品： 仔细准备测定所需的样品和标准抗原，确保液体纯净，浓度和容积达到实验要求。

二、检测未知抗原的双抗体夹心法

这种检测方法需要利用针对同一抗原不同表位的两种特异性抗体。通常，这些抗体被称为匹配抗体对。其中，一种抗体被包被到多孔板表面，作为捕获抗体用于固定抗原；另一种抗体则被酶偶联，负责抗原的检测。

1.包被：
①使用包被缓冲液将捕获抗体稀释至1～10 μg/mL的蛋白质浓度。
②每个ELISA板孔中加入0.1 mL稀释后的抗体溶液，在4°C下孵育过夜。
③次日，弃去孔内溶液，并使用洗涤缓冲液清洗每个孔三次，每次3分钟（以下简称“洗涤”）。

2.封闭：
①在各板孔中加入0.1 mL的封闭液，并在37°C下孵育1小时。
②随后进行洗涤以去除未结合的封闭液。

3.加样：
①将稀释后的待测样品（使用稀释液按一定倍数稀释）和梯度稀释的抗原标准品，各加入0.1 mL到反应孔中。
②在37°C孵育1小时后进行洗涤。
③同时设置空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔，以确保结果的准确性。

4.加酶标抗体：
①向各反应孔中加入0.1 mL新鲜稀释的酶标抗体，稀释倍数需通过预实验优化确定。
②在37°C孵育0.5至1小时后洗涤。

5.加底物显色：
①向各反应孔中加入0.1 mL新鲜配制的TMB底物溶液。
②在37°C条件下避光反应10至30分钟，具体时间取决于反应显色效果。

6.终止反应：
向每个反应孔中加入50 μL的2M硫酸，以终止显色反应。

7.结果判定：
①将ELISA板放置于酶标仪上，读取每个孔在450 nm处的光密度（OD）值。
②每个孔的OD值均需减去空白对照孔的OD值以校正基线。
③使用标准样品的OD值绘制标准曲线，从而计算各样品中的抗原浓度。

三、检测未知抗体的间接法

间接法通过建立抗原-抗体的多层结合作用，检测样品中未知抗体的含量。首先将抗原固定在多孔板表面，特异性抗原的一抗结合到该靶标抗原上，然后通过酶标记的二抗结合到一抗上，以使检测结果更加灵敏。

1.包被：
①用包被缓冲液将抗原稀释至1～10 μg/mL的蛋白质浓度。
②在每个ELISA板孔中加入0.1 mL稀释后的抗原溶液，在4°C条件下过夜孵育。
③次日，弃去孔内溶液，并使用洗涤缓冲液清洗板孔三次，每次3分钟（以下简称“洗涤”）。

2.封闭：
①向各板孔中加入0.1 mL的封闭液，并在37°C下孵育1小时。
②随后进行洗涤以去除未结合的封闭液，提高特异性。

3.加样：
①分别在反应孔中加入0.1 mL经过一定稀释倍数的待测样品和梯度稀释的抗体标准品。
②在37°C下孵育1小时后洗涤，以确保样品和标准品充分结合。
③设置空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔，以用于结果比较和校验。

4.加酶标二抗：
①向各反应孔中加入0.1 mL新鲜稀释的酶标二抗，稀释倍数需通过预实验进行优化。
②在37°C下孵育0.5至1小时后进行洗涤。

5.加底物显色：
在各反应孔中加入0.1 mL新鲜配制的TMB底物溶液，避免光照，在37°C反应10至30分钟。

6.终止反应：
加入50 μL的2M硫酸到每个反应孔中，以终止显色反应。

7.结果判定：
①使用酶标仪在450 nm波长下读取每个孔的光密度（OD）值。
②从每个孔的OD值中减去空白对照孔的OD值进行基线校正。
③根据抗体标准品绘制标准曲线，以计算每个待测样品中的抗体含量。

四、ELISA测定细胞因子浓度

1.加样：
①将IL-10标准品稀释至以下浓度：500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 pg/mL。分别将标准品和样本加入每个板孔中，100 μL/孔。
②同时设置空白对照孔，加入等量稀释液，而不加入样品。

2.加入标记抗体：
①使用试剂盒提供的洗液，将生物素标记的抗体按1:100稀释，制备工作液。
②每孔加入50 μL，轻轻混匀后盖上封板膜，在37°C条件下孵育90分钟。

3.洗板：
弃去孔内的液体，每孔加入300 μL洗液，停留1分钟后弃去，并用滤纸吸干板孔中的残留液体。此过程重复4次，以确保彻底清洗。

4.加入酶标：
①将链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）工作液按1:100稀释。
②每孔加入100 μL，盖上封板膜，在37°C下孵育30分钟。

5.再次洗板：
重复步骤3，确保去除未结合的酶标试剂。

6.显色：
每孔加入100 μL TMB底物溶液，避光孵育37°C 10分钟。根据蓝色显色程度可调整反应时间。

7.终止反应：
加入100 μL终止液（Stop Solution）至每个孔中。

8.检测：
迅速将板置于酶标仪上，测定每孔在450 nm波长处的吸光度。

9.数据分析：
①根据所测得的OD值，绘制标准曲线。
②计算样本中IL-10的浓度，并根据样品的稀释倍数做相应的调整。