培养注意事项

1.该细胞并不形成一致的单层，而是形成集落；

2.该细胞会使培养基快速变酸，且生长缓慢，故传代后 48 小时内不应扰动；

3. 普通TC处理的培养瓶或皿不能使细胞很好的贴壁，培养难度较高，需使用 Corning 的 cellbind 细胞培养瓶，或者使用多聚-L-赖氨酸溶液包被过的培养皿；

4.在细胞运输途中，多数细胞会从培养瓶底分离，大片悬浮在培养基中，按照收货注意事项处理即可恢复正常。

                                                     正常生长的细胞

                                                             聚集生长的细胞

收货处理方式

收货后，如果发现细胞漂浮或成团，可按下面的步骤进行处理：

1.将培养瓶内的所有培养基，转入无菌离心管，离心收集细胞（1200rpm 3min）；

2.去掉上清，用PBS重悬细胞，将细胞收集到一个离心管中，PBS震动离心管混匀即可，再次离心（1200rpm 3min）；

3. 去掉上清，加入1ml左右0.25%胰酶，重悬混匀细胞。震动离心管，混匀即可，不能吹打。放入培养箱，消化细胞，消化时间3分钟左右；

4. 消化完毕后，用移液枪轻轻吹打细胞悬液，使细胞团分散。加入5ml含血清的培养基，混匀后终止消化，离心（1200rpm 3min）；

5.去掉上清，加入5-7ml相应完全培养基混匀，轻轻/反复吹打细胞，接种于无菌T25瓶中（接种容器应提前用对应培养基浸润）。

 

 

                                                               细胞到货漂浮

                                                               细胞接种量少

传代步骤

1.吸出原培养液；

2.加入2ml左右PBS，轻轻晃动培养瓶，润洗细胞，吸出PBS，丢弃；

3.加入1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶，使之浸润所有细胞；

4.放入培养箱消化，消化5分钟左右，显微镜下可看到，细胞块中间的细胞明显分离变圆，且自然脱落（全程不要拍打培养瓶）；

5.加入3ml含血清的培养基，终止消化，轻轻/反复吹打细胞，在显微镜下观察。细胞悬液中，细胞尽量为单个状态；

6.收集细胞悬液，离心（1200rpm 3min）。离心完，吸出上清，丢弃；

7.加入新鲜培养基，吹打几下，混匀细胞即可。按需接种到新培养瓶，补充足量培养基，拧松瓶盖，或使用透气瓶盖进行培养；

8.检查培养箱的二氧化碳、温度及水盘。

 

传代比例和频次

推荐1:2~1:4传代，每4~5天传代一次。

 

换液步骤

吸出旧培养基，沿培养瓶侧边加入新培养基；

每3天换液一次。

 

冻存步骤

1. 配置冻存液。推荐配比：55%（基础培养基1640）+40%(血清)+5%（DMSO）；

2. DMSO配置时会放热，一定要等冻存液冷却后再使用，避免灼伤细胞；

3.细胞消化好后用新鲜培养基中止，制成细胞悬液；

4.1200rpm 3min 离心后去上清，尽量吸干净上清；

5.加入配置好的冻存液，重悬，建议一个T25长满冻存1支，或者细胞计数后，按照2-5×106cells/支的比例冻存；

6.将分装好的冻存液转入程序冻存盒，放入-80℃冰箱过夜；

7.从-80℃冰箱取出冻存管，迅速转移到液氮，长期保存。

 

复苏步骤

1. 将水浴锅预热至37℃，准备好干净的一次性手套，向一个无菌离心管内，加入9ml无菌培养基；

2.将细胞从液氮罐中取出，放入一次性手套中，迅速没入水浴锅。摇晃冻存管加速溶解，以1分钟内全部溶解为宜；

3. 在超净台中，将复苏好的细胞液，加入到装有新鲜培养基的离心管内，1200rpm/min离心3分钟，离心完毕，去掉上清；

4.用适量与细胞对应的完全培养基重悬细胞，接入到无菌容器（培养瓶或培养皿）中，补充一定量培养基，放入培养箱培养；

5.溶解过程要迅速，已溶解的冻存细胞不能在常温下存放太久，需尽快离心去除DMSO。