常规观察：

1.培养液的颜色与透明度

2.细胞形态变化

3.细胞污染的观察及防治

4.细胞生长状况

一、培养液的颜色和透明度

状态好的细胞透明度大，折光性强，轮廓清楚，分裂期细胞多见。

状态差的细胞，失去原来的特点，胞质出现空泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。

培养液澄清，培养液颜色在指示剂的反映下显示为中性范围。

二、培养细胞的形态观察

1.常规采用倒置显微镜观察，最基本有两种形态：

倒置显微镜

2、活细胞的观察

相差显微镜

把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。

培养皿上下尽量平行，瓶壁不能太厚，划痕不宜过多，去除漂浮细胞及死细胞。

三、细胞生长状况的观察

1、培养细胞活力测定

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

a、培养细胞活力测定——台盼蓝法

活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；

方法：

1.将细胞悬液以0.5ml加入试管中；
2.加入0.5ml 0.4%台盼蓝染液，染色2一3分钟；

3.吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；
4.镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼蓝染上色，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

b、细胞活力测定---MTT比色法

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝
四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。

c、细胞计数

它是了解细胞生长状态的量化指标。

制备细胞悬液，密度不低于10000细胞／ml，用10×物镜观察计数板四角大方格的细胞数。

计数：细胞数／ml原液＝（4大格细胞数之和÷4）×104

注意要点：细胞分散均匀制成单个细胞悬液；计数时数上不数下；数左不数右。

d、流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）

细胞表型分析、胞内蛋白的检测、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡

四、细胞凋亡的检测

在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外侧。磷脂结合蛋白V(Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外侧的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外侧，且对PI高染），进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

Annexin V/PI双染

活细胞为（Annexin V-/PI-）

坏死细胞为（Annexin V+/PI+）

凋亡细胞（Annexin V+/PI-）