细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命，最后裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬的过程，也称为程序性细胞死亡。细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定的方式，凋亡过程是由基因控制的细胞主动死亡过程。
细胞凋亡从形态学观察，凋亡细胞表现出胞质皱缩，质膜出芽，磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，染色质凝缩和DNA断裂等。研究细胞凋亡可以了解疾病发生机制，细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如凋亡不足引发恶性肿瘤、病毒性疾病和自身免疫疾病。凋亡过量则可能产生艾滋病、重症肝炎与老年性痴呆症、帕金森氏症等，因此研究细胞凋亡已成为生命科学、医学病理学、药理学等学科的热点领域。
细胞凋亡过程
细胞凋亡的主要形态学特征包括：染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。
细胞凋亡大致可以分为三个阶段，包括凋亡早期、凋亡中期和凋亡晚期。每个阶段都具有各自的细胞形态学变化和分子特点。
凋亡早期：细胞膜结构发生变化，磷脂酰丝氨酸外翻；通透性改变；起始Caspase激活；线粒体膜电位改变；
凋亡中期：效应Caspase被激活，细胞内特定蛋白被Caspase切割；
凋亡晚期：DNA断裂；凋亡小体形成；凋亡小体被吞噬细胞吞噬。
细胞凋亡中各阶段特征
细胞凋亡的信号通路
细胞凋亡检测有很多种方法：根据凋亡细胞固有的形态特征，利用光学显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和透射电子显微镜等观察细胞形态；根据细胞凋亡过程中不同时期的变化检测是否发生凋亡，常见的有Caspase活性检测、Annexin V检测、线粒体膜电位检测、TUNEL检测等。细胞发生凋亡时，不同时期在不同区域（如细胞膜、细胞浆、线粒体、细胞核等）会发生不同的生理生化改变。因此，针对不同时期的细胞凋亡检测要采用不同的方法。
主要和大家介绍一下Annexin V/PI法检测细胞凋亡的原理、操作步骤、注意事项、优缺点和常见问题及解答。
正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。
Annexin-V染色原理
凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）从胞质转至胞外。Annexin-V（模联蛋白-V）。是一种磷脂结合蛋白，与PS有强亲和力。
操作步骤（贴壁细胞为例）
1、对照管的设置
1）空白管：诱导凋亡的细胞不加染料，用来调节电压；
2）单染管：分别需要只加PI和荧光标记的Annexin V两个单染管，用来调节补偿；
3）实验管：诱导凋亡的细胞加本次实验的所有荧光染料；
4）阴性管：正常培养细胞加入染料，确认细胞正常状态，排除假阳性。
2、细胞处理及染色
1）取对数生长期细胞接种于6孔板或6cm培养皿（用什么培养皿取决于所培养的细胞，保证最终收集的细胞数大于5×105个）；
2）根据实验需要处理细胞。收集细胞时将培养液吸至离心管内，PBS洗涤细胞一次，用不含EDTA的胰酶消化细胞，并收集于离心管中（悬浮细胞可直接离心收集）；注：用胰蛋白酶消化然后使细胞在最佳细胞培养条件和培养基中恢复约30分钟，然后再染色。胰蛋白酶消化会暂时破坏质膜，允许Annexin V结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质表面上，从而导致假阳性染色。
3）将收集的培养基和细胞混匀，4℃，300g，离心 5min，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次4℃，300g，离心5min；
4）加入1×Binding Buffer，将细胞调节成相同浓度（一般为1×106/mL）；
5）取 1-2×105 个细胞悬液于流式管中，加入适量标记了荧光染料的 Annexin V和适量PI，轻轻混匀；
6）室温避光孵育15-20 min；
7）加入 300 μl PBS 重悬细胞，尽快（1 小时内）用流式细胞仪检测。
Annexin-V/PI实验结果
注意事项：
1、检测贴壁细胞时，若不好控制消化时间，建议用Accutase细胞消化液，对细胞损伤小且不会改变细胞膜上PS的分布。
2、选择Annexin-V的荧光染料时要考虑细胞的自发荧光，特别是培养时间久或药物处理的细胞，一定注意细胞代谢物药物本身的荧光，一般来说细胞代谢物的自发荧光会干扰FITC/PE，所以可建议用Annexin-V APC，药物的干扰可查看药物本身的发射光谱是否会对检测选择的染料有影响。
3、细胞染色完成后，禁止固定，尽快检测完，可将检测管放冰上，可减少外界环境对检测结果的影响。
4、实验设计时，要考虑到补偿，设全单染管调节补偿，若是有不同的处理组，设置单染管时可从每个组中分别取一点细胞混合来染色。
5、若是第一次做药物对细胞凋亡影响的实验，建议做阳性对照组，可选择用Etoposide来诱导凋亡作为阳性对照。
6、在做凋亡统计时一般指统计前凋亡，因为只有前凋亡才有意义，当然也有文献统计总的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和），单纯的统计晚期凋亡比例意义不大。
优点：
1、简便、快速；
2、可准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。
缺点：
1、制备贴壁细胞样品时，容易因消化和吹打造成细胞额外损伤，从而夸大了实验结果，增加了数据变异度；
2、凋亡细胞的本底荧光或非特异染色的特性会增强，造成荧光飘移，导致定量不准。
常见问题与解答：
1.如何避免出现假阳性结果？
细胞接种不易过密：接种对数生长期的细胞时密度不要＞1*106，以免细胞培养过程中自身引起凋亡，而非外界处理因素；避免消化过度：因消化过度可能会造成PS外翻，得到假阳性的结果；操作尽量轻柔：收集细胞时力度过大很可能造成细胞膜损伤，导致细胞膜的磷脂层暴露，从而结合Annexin V，导致假阳性，因此处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤。
2.为什么必须收集细胞上清？
因为凋亡的细胞可能会脱壁，悬浮于培养基，所以必须收集上清再离心取沉淀，合并胰酶消化下来的细胞，否则检测出来的凋亡比例可能会减少。
3.为什么在染色后1h内就要上机检测？
由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析；PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大，所以建议在一个小时内检测。
4.上机检测前，细胞应怎么处理？
上机检测时，必须重悬成细胞悬液后再检测，否则容易堵仪器管道；如果细胞过多或聚团严重，可先用300目（孔径40~50 µm）尼龙网过滤，然后再上机检测。
