确保抗体验证过程中实验结果的可靠性,可以遵循以下几个关键步骤和策略:
1.分析验证原则:根据美国病理家学会及实验室质量中心发布的指南推荐,实验室必须确认验证所有的免疫组化(IHC)试验结果后才能用于临床。这包括将新的检验结果与形态学和预期结果相比较,以及与同一样本的前次检验结果进行比较。
2.整体一致性:对于临床应用的每一种已经初步验证的检验方案,新检验和前次检验或预期的实验室结果必须达到至少90%的整体一致性。如果一致性小于90%,需要探讨一致性低的原因。
3.抗体验证标准:Abcam提到,抗体验证只对特定的应用有效,需要使用始终能够特异性、选择性地与预期靶点结合的抗体。抗体的验证包括ELISA、Western blot、免疫组织化学和免疫细胞化学等多种方法。
4.ELISA验证:在开发夹心ELISA时,需要认真选择配对抗体对,确保两种抗体均能与靶蛋白特异性结合。通过加标回收率实验来验证抗体选择性,并在血浆、血清或组织裂解液中验证各抗体对的性能。
5.Western blot和IHC/ICC:IHC和ICC可以根据细胞和亚细胞的定位判定抗体是否识别了正确的蛋白。抗体的特异性则通过观察在同一组织中表达或不表达靶蛋白的细胞进行确认。
6.肽阵列和Dot blot:肽阵列是一种高通量的抗体验证方法,可以一次性测试抗体对500多种肽的特异性。Dot blot在肽阵列之前用于验证组蛋白修饰抗体,通过将几种肽连续稀释后点样到硝酸纤维素上,然后根据对照肽判定目标抗体的特异性。
7.基因敲除细胞系特异性测试:使用CRISPR/Cas9 KO人类细胞系进行敲除验证,提供了真正的阴性对照,是抗体验证的绝佳标准品。
8.确定抗体特异性的五种支柱策略:包括遗传策略、正交策略、独立抗体策略、标记蛋白的表达和免疫沉淀-质谱法。
9.抗体特异性检测:Thermo Fisher Scientific提到,他们采用两步系统性方法来进行抗体验证,即验证功能应用和高级特异性确认,包括免疫沉淀/质谱分析法、敲除、敲低、独立抗体确认、细胞处理、相对表达、中和、肽段芯片和正交方法。
10.质量控制标准物质:包括理化对照品及活性标准品,确保生产工艺的稳定及抗体药物的批间一致。
通过上述方法,可以系统地验证抗体的特异性和一致性,从而提高实验结果的可靠性和可重复性。