目前共有三种应用广泛的蛋白-DNA互作研究技术，我们称之为蛋白-DNA互作三驾马车，它们分别是：ChIP、EMSA和双荧光素酶实验。今天来聊聊该系列最后一种-双荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）。

说双荧光素酶报告基因实验前先来看看荧光素酶报告基因。

啥是荧光素酶报告基因？

荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase) 活性的一种报告系统。

荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。

然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。

荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
 

双荧光素酶报告基因实验的发展
那为啥是双荧光素酶呢？

原来，结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因实验技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时, 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。

但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。

Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶实验和海洋腔肠荧光素酶实验。

双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因实验,快速,灵敏,简便。系统还提供 PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。

对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。

双荧光素酶报告基因测试系统将使他们体会到该系统的便利。


双荧光素酶报告基因实验的应用
双荧光素酶报告基因实验目前由两个主要的应用方向，一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。

荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。
 

双荧光素酶报告基因实验的原理
其原理简述如下:

构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）

将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。

如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

双荧光素酶报告基因实验流程
动物：

1. 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

2.  设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。

3.   筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。

4.   扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。

5.培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于6孔板中，生长24小时（80%汇合度）。

6. 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

7.   用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。

8.   加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。

9. 计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。

植物：

1. 挑取单克隆于LB液体培养。

2. 将农杆菌转接到LB液体培养基中（加有与1相同的抗生素）。加入乙酰丁香和MES，28度摇床培养。

3.离心收集菌体。

4.   MgCl2重悬菌体加入AS。

5.  取正处于生长期的烟草叶片，使用针头在叶片反面扎些小孔。

6.  将侵染液装入5 ml 注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

7.   注射后荧光素酶检测试剂盒在promega发光检测仪（Promega Glomax 2020）分析荧光素酶活性。

8.   根据双报告系统测得的荧光值，算出目的基因质粒的荧光值/内参质粒荧光值（即F/R值），并算出相对于对照组的比值，求出标准误，作出直方图。