Western blot（WB）是一种用于检测特定蛋白质表达的实验技术。
它通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，然后转移到膜上，最后利用特异性抗体进行检测。
然而，在实验过程中，我们可能会遇到样本变黄的问题，这可能会影响实验结果的准确性。
本文将详细探讨导致样本变黄的原因，并提供相应的解决方案。
一、样本变黄的初步观察
在进行Western blot电泳时，如果样本在电泳1小时后变黄，这可能是由于多种因素引起的。变黄的样本可能会影响凝胶的美观，更重要的是，它可能指示着实验条件或操作中的问题。为了准确地识别问题，我们可以比较变黄样本与正常样本的图片，并记录变黄的具体时间点。
二、可能的原因分析
局部pH变化的影响
1.电泳指示剂的影响：溴酚蓝作为电泳指示剂，其变色范围在pH 3.0到4.6之间。电泳过程中，由于水的电解作用，负极会产生氢气，正极会产生氧气，这可能导致电泳槽中局部pH值的变化。
2.操作步骤：在电泳前，应检查电泳液的pH值，确保其在适宜的范围内。如果电泳液反复使用，可能需要更换新的电泳液以保持pH稳定。
电泳液问题
1.电泳液配置：电泳液的pH值、离子强度和成分都可能影响电泳结果。如果电泳液配置不当或反复使用，可能会导致其性能下降，从而影响电泳效果。
2.操作步骤：在实验前，应检查电泳液的新鲜度和配制方法，确保其符合实验要求。如果电泳液中出现杂质或污染物，应更换新的电泳液。
电泳条件的影响
1.电流、电压和时间：电泳过程中的电流、电压和时间等条件也会影响实验结果。如果电流过大或电泳时间过长，可能会产生过多的热量，导致凝胶或样本的烧焦或变性。
2.操作步骤：优化电泳条件，如调整电流和电压，控制电泳时间。通常，电泳电压设置在80-120V之间，具体取决于凝胶的浓度和大小。
操作步骤详解
1.蛋白样本提取制备：
细胞或组织裂解：使用适当的裂解液，如RIPA裂解液，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
蛋白定量：使用BCA或Bradford方法进行蛋白定量，确保上样量准确。
电泳上样样品的准备：将蛋白样本与上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟，使蛋白质变性。
2.电泳：
PAGE胶的制备：根据靶蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。
上样与电泳：将蛋白样本加载到凝胶中，设置适当的电压进行电泳，通常在80-120V之间。
3.转膜与显色：
胶中蛋白的检测：在转膜前，确保凝胶中的蛋白已经正确分离。
蛋白转膜：将凝胶中的蛋白转移到膜上，可以使用半干法或湿法转膜。
膜上蛋白的检测：使用丽春红或其他染料对膜上的蛋白进行检测。
膜的封闭：使用5%脱脂奶粉或BSA溶液对膜进行封闭，以减少非特异性结合。
一抗和二抗的孵育：使用特异性抗体对目标蛋白进行检测，随后使用酶标记的二抗。
显色：使用ECL等化学发光试剂进行显色，以检测目标蛋白。
通过以上步骤，可以详细地进行Western blot实验，并在遇到样本变黄等问题时，能够迅速定位原因并采取相应的解决措施。
三、实验操作检查
检查电泳液的新鲜度和配制方法
1.新鲜度检查：电泳液使用前应检查其是否新鲜，避免使用过期或长时间存放的电泳液，因为这可能导致pH值变化和性能下降。
2.配制方法：确保按照正确的比例和顺序添加电泳液的各种成分。例如，对于Tris-Glycine SDS Running Buffer，应按照10X浓度配制，并在使用前稀释至1X。
提供电泳条件（电流、电压、时间）的优化建议
1.电流和电压：电泳时，上层胶使用低电压恒压电泳，通常设置为80V，约30分钟；溴酚蓝进入下层胶时，使用高压恒压电泳，设置为120V，直至溴酚蓝到达胶的底端处附近。
2.时间控制：电泳时间应根据蛋白marker的迁移情况来确定，通常当loading buffer中的溴酚蓝跑至胶的底部1cm处停止电泳，整个过程大约需要1.5至2小时。
强调实验过程中的监控和调整的重要性
1.监控pH变化：电泳过程中应定期检查电泳液的pH值，特别是在长时间电泳或电泳液反复使用时，以避免pH变化对实验结果的影响。
2.温度控制：电泳时应监控电泳槽的温度，过高的温度可能导致蛋白质变性，影响电泳结果。必要时，可以在电泳槽中加入冰块或使用低温电泳。
四、结论与建议
样本变黄可能是由局部pH变化、电泳液问题以及电泳条件引起的。为了解决这一问题，建议在实验前仔细检查电泳液的新鲜度和配制方法，优化电泳条件，并在实验过程中密切监控pH值的变化。通过这些措施，可以最大限度地减少样本变黄的风险，确保Western blot实验的准确性和可靠性。提供预防和解决样本变黄的策略
1.更换新鲜的电泳液：定期更换电泳液，避免使用过期或性能下降的电泳液。
2.优化电泳条件：调整电流、电压和时间，确保电泳条件适合目标蛋白的分离。
3..监控实验过程：在实验过程中密切监控pH值、温度等条件，及时调整以避免样本变黄。
当遇到样本变黄等问题时，应从电泳液的新鲜度、配制方法、电泳条件等多个方面进行系统性排查，以确定问题的根本原因，并采取相应的解决措施。精确的实验操作和严格的条件控制对于Western blot实验的成功至关重要。即使是微小的条件变化，也可能对实验结果产生显著影响，因此必须严格按照操作规程执行，并严格控制实验条件。
