一、实验动物
新西兰大白兔
二、实验主要试剂
1、PBS：PBS缓冲液。
2、DMEM细胞生长培养液：临用前根据需要加10%胎牛血清（CellMax），后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL，置于4℃冰箱保存。
3、抗生素：双抗试剂。
4、细胞冻存液：生长培养基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清，加入10%的DMSO混合均匀，置于4℃冰箱保存。
三、实验步骤
1、取成年新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气处死后，取下兔子的双腿，立即用75%乙醇浸泡。
2、移入细胞房内，去除双腿表面的皮毛及肌肉，剪取关节段，移至超菌工作台内。
3、PBS洗涤数次，用手术刀或弯剪将关节表面的软骨组织取下。
4、软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，将软骨组织剪成1mm3的大小。移到离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；
5、 4℃静置5min；弃上清，PBS洗涤，去上清。加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化2H；
6、加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
7、细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全展开后即可固定做原代鉴定。
四、注意事项：
可用手术刀取材；尽量取新生的大白兔取材；这样细胞活性高，量大，取材方便；
在消化时可以放置在摇床上，效率比放置在孵箱里高；
消化时多观察，至组织块大致消失就可以终止消化了。接种后48H再换液，这样细胞才帖牢不掉。第三、四天多观察，细胞在会爆发：
细胞形态
膝关节软骨原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞三角或多角形，生长缓慢，培养3-5天进入快速增殖期。
