一、实验原理
免疫荧光染色 (Immunofluorescence, IF) 的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。
该技术主要包括直接法和间接法。
1.在直接法中：目的蛋白与标记有荧光素的一抗结合，通过荧光显微镜可直接观察到荧光信号。
2.而在间接法中：目的蛋白与一抗结合后，再与带有荧光基团的二抗结合，最终在荧光显微镜下观察到荧光信号的产生。
这种方法增强了荧光信号的灵敏度和特异性，使得目标蛋白更容易被检测和定位。
二、实验步骤（标本处理细胞或组织）
1.细胞爬片
①细胞准备:将培养皿中已爬好细胞的玻片，使用PBS快速洗涤3次，小心地将细胞脱离玻片表面。
②固定:将细胞样本置于4%多聚甲醛或其他固定液中，在常温条件下固定20分钟，随后使用PBS洗涤三次，每次3分钟。需要注意的是，常用的固定液可分为两类：一类是交联固定剂，如多聚甲醛等；另一类是有机溶剂，例如丙酮、甲醇、乙醇等。
③通透:在室温下将细胞样本处理至少10分钟，使用0.1% Triton X-100进行通透处理，随后再次用PBS洗涤三次，每次3分钟。
需根据靶蛋白的定位和抗体的识别位点来决定是否需要进行通透处理。若靶蛋白位于胞内，则通常需要对细胞进行通透处理。通透处理方法的选择也与固定方法有密切关系。对于醛类固定的样本，可使用0.1%-0.3% Triton X-100进行通透处理；而对于有机溶剂固定的样本，则通常无需进一步通透操作。
2.冰冻切片
①标本准备:将待切片的样本放置在含有PBS的容器中，在室温条件下平衡10-20分钟。
②固定:以4%多聚甲醛在常温下固定样本30分钟，随后用PBS进行三次洗涤，每次洗涤持续3分钟。
③通透:使用0.2% Triton X-100在室温下进行通透处理，持续15分钟，再次用PB5进行三次洗涤，每次洗涤持续3分钟。
确保实验进行过程中每个步骤都严格按照上述步骤进行，以获得准确且可靠的实验结果。
3.石蜡切片（脱蜡）
①在二甲苯I号缸中浸泡20min;
②在二甲苯Ⅱ号缸中浸泡20min;
③在无水乙醇I号缸中浸泡5min;
④在无水乙醇Ⅱ号缸中浸泡5min;
⑤在95%乙醇中浸泡5min;
⑥在80%乙醇中浸泡5min;
⑦在60%乙醇中浸泡5min;
使用去离子水进行3次浸洗，每次1分钟。在这里需要特别注意，第一号和第二号缸是指不同的容器，但它们所含液体的成分是相同的。
4.抗原修复:
首先，取适量的抗原修复液置于烧杯中，确保修复液能够覆盖切片架，然后盖上盖子。
待修复液煮沸后，将预处理的切片放入其中，盖上盖子，持续加热修复液约15分钟。
待完成后，将样品移至通风厨房中自然冷却。
常见的抗原修复液种类包括Tris-EDTA（pH 9.0）抗原修复液、EDTA（pH 8.0）抗原修复液、柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液以及蛋白酶K抗原修复液等。
这些修复液在实验中具有不同的用途和特点，根据具体实验要求选择适当的抗原修复液。
三、间接免疫荧光法操作步骤
1.清洗:
将固定好的样片置于装有PBS的培养皿中，进行3次清洗，每次持续5分钟。
在每次清洗后，务必使用吸水纸将多余的液体吸干净，然后转移到下一个培养皿中进行清洗。
务必注意保持样片湿润避免干片现象的发生。
2.封闭:
将样片置于干燥的培养皿内，滴加3%BSA PBST(0.1%Tween)封闭液，确保样片完全被覆盖，然后将其放入湿盒中，在室温下孵育1小时或者在4℃过夜。
封闭液可以选择与二抗相同来源的血清或者BSA等，例如，若二抗为山羊抗小鼠，应选择山羊血清作为封闭剂。
3.一抗孵育:
利用吸水纸除去样片表面多余的封闭液，然后将样本完全浸泡于适当稀释比例的一抗溶液中，在室温下孵育2小时或者在4°C过夜。
随后用PBST(0.1%Tween)清洗样片，共进行3次，每次持续5分钟。
这一步骤是为了确保一抗的充分反应和去除非特异性结合物质。
选择一抗原则:
1.针对一些内源性IgG丰富的组织，我们应该尽量选择与宿主不同来源的一抗，以避免二抗与样本内源性IgG发生交叉反应。
2.当多个一抗使用间接荧光标记法时，需要特别注意一抗的种属来源要不同，以确保实验结果的准确性和可靠性。
3.荧光二抗孵育:将样本滴加50-100μL稀释后的标记有荧光素的二抗，确保样本完全浸没于二抗液中，然后将其放入室温的湿盒中孵育1小时。
使用含0.1% Tween的PBST溶液清洗样本，每次清洗5分钟，共清洗3次。自荧光二抗添加开始，后续操作需在避光条件下进行。
4.染核:在样本上滴加50-100μL DAPI-PBS，让其完全浸没于DAPI溶液中，然后将样本放入室温的湿盒中，在避光条件下孵育5-10分钟。
使用PBST溶液清洗样本，每次清洗5分钟，共清洗2次。
5.封片:滴加适量的封片剂，确保样品被封藏在盖玻片和载玻片之间。
6.成像:使用荧光显微镜进行观察，根据不同荧光染料的特性选择相应波长的激发光进行成像。
