一、引言

Western Blot（WB）实验广泛用于检测特定蛋白质的表达和定量分析。

然而，由于其操作步骤的复杂性和结果的多变性，WB实验常常被科研人员戏称为「玄学」实验。

本文将提供一些实用的操作指南和技巧，以帮助科研人员更好地掌握这一技术。

 

二、WB实验的基本流程

WB实验的标准操作步骤包括样品准备、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗和二抗孵育、显影等。

每个步骤都对最终结果有着决定性的影响。

1.样品准备：

选择合适的蛋白裂解液，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解。SDS-PAGE电泳：根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度，并确保样品在上样前充分变性。

2.转膜：

将分离的蛋白质转移到固相载体上，如硝酸纤维素或PVDF膜。

3.封闭：

使用5%脱脂奶粉或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点。

4.抗体孵育：

先后使用一抗和二抗进行孵育，一抗识别目标蛋白，二抗与一抗结合并带有检测标记。

5.显影：

使用化学发光或染色方法使膜上的蛋白条带显色，以便检测和分析。

 

 

三、WB实验中的「玄学」因素

WB实验中的「玄学」因素主要包括蛋白质提取和降解问题、电泳和转膜的不一致性、抗体的选择和特异性以及实验条件的微妙变化。

1.蛋白质提取和降解问题：

样品制备过程中，蛋白质可能会降解，导致条带模糊或出现非特异性条带。为避免这种情况，应在低温条件下操作，并加入蛋白酶抑制剂。

2.电泳和转膜的不一致性：

电泳条件（如电压、时间）和转膜效率不一致可能导致条带迁移异常。应优化电泳条件，并确保转膜过程的一致性。

3.抗体的选择和特异性：

非特异性抗体结合可能导致假阳性结果。选择高特异性的抗体，并进行适当的抗体稀释和验证。

4.实验条件的微妙变化：

pH值、温度、时间等条件的微小变化可能显著影响实验结果。应严格控制实验条件，并进行必要的优化。

 

四、解决WB「玄学」的策略

1.优化操作技术

为了减少WB操作过程中的变异性，以下是一些技巧和最佳实践：

样品制备：

确保在低温条件下操作，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。使用新鲜样本，并在制样过程中冰上操作。

电泳和转膜：

优化电泳条件，如电压和时间，以确保蛋白质的有效分离。转膜过程中，使用丽春红S检测确保充分、完全、适度的转膜。

对于大分子蛋白，减少转膜液中甲醇的百分比，并添加SDS至终浓度为0.1%，以避免蛋白沉淀。

封闭和洗涤：

使用5%脱脂奶粉或BSA进行封闭，以降低背景信号。

提高洗涤次数和吐温20浓度，以确保非特异性结合被完全洗掉。

抗体孵育：

将一抗和二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。

一抗孵育结束后，用TBST Buffer洗涤4次，每次5分钟。二抗孵育结束后，同样进行多次洗涤。

显影：

在避光环境中，将ECL化学发光试剂A液、B液1:1配置，充分混匀后使用。

设置合适的曝光时间进行图片采集，可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像。

2.使用高质量的试剂

使用高品质抗体和其他试剂对于WB实验的成功至关重要。选择高特异性、品质稳定的抗体，并进行适当的抗体稀释和验证。

有时，更换二抗或一抗可以显著改善结果。

3.标准化实验条件

通过标准化实验条件来提高实验的可重复性。这包括统一的电泳条件、转膜时间、抗体稀释比例以及洗涤液的配制。

例如，使用含有5%脱脂奶粉的1xTBS进行封闭，室温1小时。

4.结果的准确解读

正确解读WB实验结果，包括条带的定量分析和背景噪音的评估，是实验成功的关键。使用图像分析软件进行条带的定量，并进行重复实验以验证结果的可重复性。

对于条带大小不正确的情况，考虑多聚体或蛋白降解的问题，增加还原剂（DTT）并充分变性。

 

WB实验之所以显得「玄学」，主要是因为其步骤繁多且对操作条件极为敏感。

然而，通过细致的操作、合理的实验设计和高质量的试剂使用，可以将「玄学」转变为有迹可循的科学。

理解WB实验的复杂性并采取适当的预防措施，可以帮助科研人员获得更可靠和可重复的实验结果。