蛋白 - 蛋白互作是国自然研究中几乎所有项目均会涉及的核心内容，以下梳理并列举 5 项相关技术：酵母双杂交系统（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、免疫荧光（IF）共定位、邻近连接技术（PLA）。
在介绍上述技术前，需明确以下关键注意事项：
1.不同技术的功能定位存在差异：部分技术适用于靶蛋白筛选（如酵母双杂交 Y2H），部分适用于互作验证（如邻近连接技术 PLA），还有部分兼具筛选与验证双重功能（如免疫共沉淀 Co-IP 联用蛋白质谱可实现筛选，联用 WB 则可完成验证）。因此，筛选类技术一般用于预实验阶段的靶点确定，验证类技术多用于明确具体分子后的功能验证。
2.上述技术可分为细胞体系与非细胞体系（In tube）两类：细胞体系技术更贴合生理研究背景，但易受多种干预因素影响；非细胞体系技术更易验证蛋白间直接互作，但难以完全还原体内真实场景，且对蛋白纯化操作要求更高。为确保研究结论的严谨性，蛋白 - 蛋白互作验证需同时结合细胞与非细胞体系开展。
上述技术在国自然项目设计中存在 “必备项” 与 “加分项” 之分（观点仅供参考），无需在方案中全面罗列，应结合研究需求合理选择。
一、酵母双杂交系统（Yeast Two-Hybrid System，Y2H）
核心用于目的蛋白结合靶蛋白的筛选（国自然中为可选技术），真核生物转录激活因子普遍具备两个独立结构域：DNA 结合域（BD）与转录激活域（AD）。二者单独存在时无转录激活活性，仅当空间上发生靠近，方可重组为具有活性的转录激活因子，进而启动下游基因转录。
操作步骤如下：
1.构建融合蛋白：将目标蛋白（蛋白 X）与 BD 融合形成 “诱饵”，将待筛蛋白（蛋白 Y）与 AD 融合形成 “猎物”。
2.转化酵母细胞：将编码两种融合蛋白的基因分别导入酵母细胞。
3.互作介导重组：若蛋白 X 与蛋白 Y 在酵母细胞内发生互作，其融合蛋白可使 BD 与 AD 靠近，重组为活性转录激活因子。
4.结果判定：活性转录激活因子会驱动报告基因（如 HIS3、lacZ 等）表达，通过检测报告基因活性即可判断蛋白间是否存在互作。
二、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）
兼具靶蛋白筛选与蛋白 - 蛋白互作验证功能（国自然必需技术），免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）以抗体与抗原的特异性结合为核心原理，用于解析蛋白间相互作用。细胞在非变性条件下裂解时，蛋白间的生理性互作状态可得以保留，利用靶蛋白特异性抗体进行沉淀时，与之结合的互作蛋白会随靶蛋白共同被捕获。
操作步骤如下：
1.细胞处理：收集细胞并进行裂解，裂解液中需添加蛋白酶抑制剂以抑制蛋白降解。
2.上清获取：细胞裂解后离心去除沉淀的细胞碎片，收集含可溶性蛋白的上清液。
3.免疫结合：加入靶蛋白特异性抗体及蛋白 A/G 偶联磁珠（或琼脂糖珠），于 4°C 孵育以实现抗体与靶蛋白的特异性结合。
4.复合物捕获：孵育结束后离心收集结合有蛋白复合物的珠子，弃去未结合的游离蛋白。
5.非特异洗脱：用裂解缓冲液多次洗涤珠子，去除非特异性结合的杂蛋白。
6.复合物释放：加入蛋白样品缓冲液并煮沸珠子，使结合的蛋白复合物从抗体 - 珠子复合物上释放。
7.结果分析：通过 SDS-PAGE 电泳分离蛋白复合物，再结合 Western blotting（验证已知互作蛋白）或质谱分析（筛选未知互作蛋白）进行结果解读。
三、GST 下拉实验（GST pull-down）
兼具靶蛋白筛选与蛋白 - 蛋白互作验证功能（国自然一般必需技术），GST pull-down 以谷胱甘肽 S - 转移酶（GST）与谷胱甘肽（GSH）的高亲和力结合为核心原理，将 GST 融合蛋白固化于谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上作为 “诱饵”，用于捕获体系中与之发生相互作用的 “猎物蛋白”，该方法多用于体外蛋白互作的检测与验证。
操作步骤如下：
1.构建携带 GST 标签的融合蛋白表达载体，转染至原核或真核表达系统中进行蛋白表达。
2.收集表达菌株或细胞并完成裂解操作，裂解液中需添加蛋白酶抑制剂以防止目标蛋白降解。
3.将细胞裂解物与固化有 GST 标签蛋白或 GST 融合蛋白的琼脂糖珠充分混合，置于 4℃条件下孵育数小时。
4.离心收集结合蛋白复合物的琼脂糖珠，弃去未发生结合的游离蛋白组分。
5.选用适配缓冲液对琼脂糖珠进行多次洗涤，去除非特异性结合的杂蛋白。
6.向沉淀的琼脂糖珠中加入蛋白样品缓冲液并煮沸，洗脱结合的蛋白复合物。
7.通过 SDS-PAGE 电泳对洗脱的蛋白复合物进行分离，结合 Western blot 技术验证已知互作蛋白，或借助质谱分析筛选未知互作蛋白。
四、免疫荧光共定位（ImmunoFluorescence Colocalization）
通过蛋白亚细胞共定位结果佐证蛋白 - 蛋白互作关系（国自然一般必需技术），免疫荧光共定位技术是解析细胞内蛋白互作的可视化手段，其核心原理为利用两种不同发射波长的荧光标签（如绿色荧光蛋白 GFP、红色荧光蛋白 DsRed）分别标记两种目标蛋白，借助荧光显微镜观察二者在细胞内的空间分布是否重叠，进而为蛋白间的相互作用提供直观证据。
操作步骤如下：
1.构建目标蛋白与不同荧光蛋白的融合表达载体，转染至宿主细胞中实现蛋白表达。
2.待细胞培养至适宜密度后，采用固定液对细胞进行固定处理，维持细胞形态与蛋白定位。
3.依据实验需求，选用特异性荧光抗体对靶蛋白进行免疫标记（若为荧光蛋白融合表达则可省略此步）。
4.利用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像观察，采集荧光信号图像。
5.运用图像分析软件处理采集到的图像，计算共定位系数，对两种蛋白的共定位程度进行定量评估。
五、邻近连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）
核心用于蛋白 - 蛋白互作验证（国自然设计中可作为加分项），邻近连接技术（PLA）是一类兼具检测与定量功能的蛋白分析技术，可用于验证蛋白 - 蛋白互作、检测蛋白表达水平及解析翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化、糖基化等）。其核心原理为采用一对携带寡核苷酸标签的 PLA 探针（偶联寡核苷酸的二抗），当两种探针分别结合靶蛋白后，若靶蛋白存在互作则探针间距会处于临界近距离，此时探针上的寡核苷酸可在连接酶作用下形成闭环 DNA 模板；通过滚环扩增（RCA）技术实现信号级联放大后，最终以荧光或显色方式完成可视化检测。
操作步骤如下：
1.样本制备：对细胞或组织样本进行固定及透化处理，确保探针可有效结合靶蛋白。
2.封闭处理：对样本进行封闭以阻断非特异性结合位点，降低背景干扰。
3.一抗孵育：加入两种特异性一抗，分别与两种靶蛋白的不同表位特异性结合。
4.PLA 探针孵育：加入两种 PLA 探针（带寡核苷酸标签的二抗），使其与对应的一抗特异性结合。
5.连接反应：若两种靶蛋白存在互作，结合的 PLA 探针会充分靠近，此时连接酶可将探针上的寡核苷酸连接，形成环状 DNA 模板。
6.滚环扩增：采用 RCA 技术对环状 DNA 模板进行扩增，生成大量串联重复的 DNA 产物，实现信号放大。
7.检测分析：加入荧光标记的探针与扩增产物结合，通过荧光显微镜观察荧光信号，同时完成定性判断与定量分析。
