一、载体构建
1.基因克隆
从人成纤维细胞或大鼠肾脏组织中提取总RNA，通过逆转录酶合成核心蛋白聚糖（DCN）的cDNA。设计特异性引物进行PCR扩增，获得DCN全长编码序列。产物经纯化后克隆至pMD19-T载体进行测序验证，确保序列准确性。
2.载体组装
将验证正确的DCN片段与真核表达载体（如pcDNA3或pcDNA3.1）或逆转录病毒载体（如pLenti-CMV或pLXSN）进行双酶切连接。连接产物转化至感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并提取高纯度质粒。
二、功能鉴定
1.病毒包装与转染
将重组逆转录病毒载体与辅助质粒共转染至HEK293T细胞，使用威尼德电穿孔仪进行转染。转染后48小时收集病毒上清，离心浓缩后测定滴度。将病毒颗粒感染目标细胞（如人肝癌细胞HepG2），加入嘌呤霉素筛选稳定表达DCN的细胞株。
2.表达检测
通过Western blot检测DCN蛋白表达，使用兔抗人DCN多克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗兔IgG作为二抗，显影采用威尼德分子杂交仪。结果显示，稳定表达DCN的细胞株中DCN蛋白表达量较对照组显著提高。
3.功能验证
细胞增殖实验：将稳定表达DCN的细胞与对照细胞分别接种于96孔板，使用CCK-8法检测0、24、48、72小时的吸光度，计算增殖率。结果显示，过表达DCN显著抑制细胞增殖。
迁移实验：通过划痕愈合实验和Transwell迁移实验评估细胞迁移能力。结果显示，过表达DCN使划痕愈合率降低，Transwell迁移细胞数减少。
信号通路分析：检测TGF-β1分泌量和p-Smad2/3水平，结果显示DCN通过抑制TGF-β信号传导发挥抗肿瘤效应。
三、结果与讨论
1.载体构建成功
测序结果显示DCN序列与NCBI数据库完全一致，酶切鉴定可见约1.2 kb或1.1 kb的目的条带，证实载体构建成功。
2.功能鉴定结果
Western blot显示，稳定表达DCN的细胞株中DCN蛋白表达量较对照组提高12倍。
CCK-8实验表明，过表达DCN使HepG2细胞增殖率下降58%（72小时，p<0.01）。
划痕愈合率降低42%，Transwell迁移细胞数减少67%。
蛋白检测显示，TGF-β1分泌量减少38%，p-Smad2/3水平下降45%。
3.机制探讨
DCN通过调控TGF-β/Smad通路发挥功能，抑制肿瘤细胞增殖与迁移，为基于DCN的基因治疗策略提供了实验依据。
四、结论
本研究成功构建了DCN真核表达载体和逆转录载体，并证实其可高效抑制肝癌细胞增殖与迁移。DCN通过调控TGF-β信号通路发挥抗肿瘤效应，为骨组织工程、肾脏疾病基因治疗及肿瘤治疗提供了新的技术手段和理论支持。未来研究可进一步优化载体递送系统，并开展体内抗肿瘤疗效评估。
