一、实验原理

酵母双杂交系统基于真核生物转录因子的特性，典型的转录因子如GAL4由DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）组成。当BD和AD在空间上接近时，可激活下游报告基因的表达。在酵母双杂交实验中，将目标蛋白（如HSPC016）与BD融合构建诱饵载体，将待筛选的cDNA文库与AD融合构建猎物载体。若诱饵蛋白与猎物蛋白相互作用，BD和AD靠近，从而激活报告基因，通过检测报告基因的表达来筛选互作蛋白。

二、实验步骤

1.诱饵载体构建

获取HSPC016基因序列，设计特异性引物，通过PCR扩增HSPC016基因。

将扩增得到的HSPC016基因片段克隆到含有BD的载体（如pGBKT7）中，构建诱饵载体pGBKT7-HSPC016。

对构建好的诱饵载体进行测序验证，确保HSPC016基因正确插入且无突变。

2.诱饵载体自激活检测

将诱饵载体pGBKT7-HSPC016转化到酵母感受态细胞中，涂布在相应的缺陷培养基上（如SD/-Trp），筛选转化子。

将转化子点接到含有X-α-Gal的缺陷培养基上（如SD/-Trp/-His/-Ade），同时设置阳性对照（如pGBKT7-53 + pGADT7-T）和阴性对照（如pGBKT7-Lam + pGADT7-T）。

观察菌落生长情况和颜色变化。若诱饵载体有自激活活性，酵母菌落会在相应培养基上生长并变蓝；若无自激活活性，则菌落不生长或生长但不变蓝。只有无自激活活性的诱饵载体才能用于后续的互作蛋白筛选。

3.cDNA文库构建与转化

从特定组织或细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA。

将cDNA与含有AD的载体（如pGADT7）连接，构建cDNA文库。

采用化学转化或电转化等方法，将cDNA文库转化到含有诱饵载体pGBKT7-HSPC016的酵母感受态细胞中，使诱饵蛋白和猎物蛋白在酵母细胞内共表达。

4.互作蛋白筛选

将转化后的酵母细胞涂布在四缺缺陷培养基上（如SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade + X-α-Gal），筛选能够在该培养基上生长且变蓝的酵母菌落，这些菌落可能含有与HSPC016相互作用的蛋白。

挑取阳性菌落，在新的四缺缺陷培养基上进行划线纯化，进一步确认其生长和显色情况。

5.阳性克隆鉴定与分析

提取阳性克隆的酵母质粒，转化到大肠杆菌中，进行扩增和提取。

对提取的质粒进行测序，将测序结果与基因数据库进行比对，分析鉴定与HSPC016相互作用的蛋白。

可采用共免疫沉淀（Co-IP）、荧光共振能量转移（FRET）等方法对筛选到的互作蛋白进行进一步的验证。

三、注意事项

1.诱饵载体自激活：诱饵蛋白可能会自身激活报告基因的表达，导致假阳性结果。因此，在实验前必须对诱饵载体进行自激活检测，确保其无自激活活性。

2.cDNA文库质量：cDNA文库的质量直接影响筛选结果。文库应具有较高的复杂度和代表性，能够覆盖尽可能多的基因。在构建文库过程中，要注意RNA的提取质量、反转录效率和连接效率等。

3.筛选条件优化：筛选条件如缺陷培养基的成分、X-α-Gal的浓度等会影响筛选的灵敏度和特异性。需要根据实际情况进行优化，以减少假阳性和假阴性结果。

4.假阳性与假阴性：酵母双杂交实验存在一定的假阳性和假阴性率。假阳性可能是由于非特异性相互作用或酵母细胞内的其他因素导致的；假阴性则可能是由于互作蛋白的表达水平低、互作强度弱或实验条件不合适等原因引起的。因此，对于筛选到的阳性克隆需要进行进一步的验证。