技术原理与优势
1.De Novo测序突破数据库依赖：传统数据库搜索依赖已知序列，而De Novo测序通过质谱数据直接推导肽段序列，无需预先构建数据库。这一特性使其能够识别数据库中未收录的低丰度突变肽或新型变异体，为复杂样本分析提供了新途径。
2.DIA技术提升低丰度肽检测灵敏度：DIA模式通过无偏采集所有母离子及其碎片信息，避免了数据依赖采集（DDA）中低丰度肽段被遗漏的问题。结合De Novo测序，可对DIA数据中的未知肽段进行从头解析，显著提高低丰度突变肽的鉴定覆盖率。
3.同源序列检索增强功能注释：将De Novo测序结果与同源序列数据库（如UniProt、NCBI nr）进行比对，可推断突变肽的功能域、活性区域或物种归属。这一步骤不仅验证了De Novo结果的可靠性，还为突变肽的功能研究提供了线索。
优化策略
1.数据层优化：
高分辨率质谱仪：如Orbitrap Eclipse或TIMS TOF Pro 2，可提供更精确的质量测量，提高肽段测序的置信度。
多酶酶切策略：结合Trypsin、Chymotrypsin等多种蛋白酶，提高肽段覆盖率，增加低丰度肽段的检测机会。
先进碎裂技术：采用HCD与ETD结合的碎裂模式，可区分同分异构体（如亮氨酸与异亮氨酸），减少序列推导的歧义。
2.分析层优化：
多算法交叉验证：使用PEAKS、Novor、DeepNovo等多种De Novo算法，筛选一致性高的肽段序列，降低假阳性率。
二级修饰识别：通过算法处理翻译后修饰（PTMs）干扰，确保突变肽序列的准确性。
反向匹配验证：将预测肽段反向匹配原始质谱图，增强结果的可靠性。
3.同源性搜索层优化：
多数据库联合比对：结合公共数据库（如UniProt、NCBI nr）与自建数据库（如转录组翻译库），提高同源序列检索的灵敏度。
结构比对工具辅助：使用HHpred等工具，辅助低同源区段的功能识别，弥补序列相似性不足的缺陷。
实际应用场景
1.非模式生物蛋白质组研究：在植物、昆虫、微生物等物种中，数据库覆盖度低，De Novo辅助的DIA同源序列检索可生成候选肽段，并通过同源比对锁定近源物种序列，构建进化树与蛋白功能网络。
2.低丰度突变肽鉴定：在癌症研究中，肿瘤细胞的低丰度突变肽可能是潜在的治疗靶点。通过De Novo测序与DIA结合，可高效鉴定这些突变肽，为精准医疗提供依据。
3.抗体药物研发：在抗体人源化改造过程中，De Novo测序可解析抗体轻链/重链CDR区序列，同源比对可判断其与已知抗体的亲缘关系，优化抗体设计。
