（RNA→cDNA）是分子生物学中一种重要的实验技术，它允许研究人员从RNA模板合成互补的DNA（cDNA）。
一、实验前准备
1. RNA样品：确保RNA样品完整且未被降解，质量良好。
2.逆转录试剂盒：选择适合的逆转录试剂盒，并按照说明书准备所需试剂。
3.实验器材：无RNase的离心管、移液器、PCR仪等。
二、实验步骤
1. RNA的预处理 基因组DNA（gDNA）去除（可选步骤，根据实验需要）：
在RNase-free离心管中，按照说明书推荐的比例加入RNase-free ddH2O、5×gDNA Wiper Mix和RNA样品，总体系通常为10μL。
混匀后短暂离心，进行gDNA去除反应。
2. 第一链cDNA合成 配制预混液：
在新的RNase-free离心管中，按照说明书推荐的比例加入RNase-free ddH2O、逆转录引物（如Oligo(dT)或随机引物）、10×RT Mix和HiScript II Enzyme Mix（或其他逆转录酶混合物）。
混匀后短暂离心，得到预混液。
3.加入预混液：
将预混液加入到上一步处理好的RNA样品中，每管加入10μL，混匀后短暂离心。
4.逆转录反应：
将反应管放入PCR仪中，设置合适的反应条件进行逆转录。常见的反应条件如：25℃ 5min（退火），50℃ 15min（逆转录反应），85℃ 5min（酶失活）。
三、实验注意事项
1.防止RNase污染：
实验操作应在洁净的环境中进行，穿戴干净的手套和口罩，使用无RNase的离心管和枪头等耗材。
2.反应液配制：
在冰上操作完成反应液的配制，以防止RNA降解。
3.cDNA保存：
逆转录后的cDNA产物可立即用于后续实验或-20℃保存。避免反复冻融，以免影响产物质量。
四、cDNA质量评估
1.电泳检测：
可以取少量cDNA产物进行电泳检测，观察电泳条带的分布情况。理论上，逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段，电泳条带应均匀分布在泳道上。
2.PCR扩增验证：
使用已知基因的引物对cDNA进行PCR扩增，以验证cDNA的质量和完整性。
五、结论
逆转录实验是分子生物学研究中的一项基础技术，通过该实验可以从RNA模板合成cDNA，为后续的实验研究提供重要的材料。
在实验过程中，需要注意防止RNase污染、正确配制反应液以及合理保存cDNA产物等关键步骤，以确保实验结果的准确性和可靠性。
