巨噬细胞作为免疫系统的核心组成部分，发挥着重要的免疫防御和炎症调控功能。为了更深入地了解它们的生物学特性和功能，小鼠巨噬细胞培养成为不可或缺的研究手段。

通过精心设计的培养实验，研究人员可以模拟不同免疫环境，深入研究巨噬细胞的增殖、分化、和免疫应答。

一、巨噬细胞的简化生命史

巨噬细胞的分化、分布和激活

巨噬细胞的生长和分化依赖于决定谱系的细胞因子，例如巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以及与造血器官中基质的相互作用。

IL-3、KIT、肿瘤坏死因子 (TNF) 家族蛋白和 TNF 受体相关分子，以及关键转录因子如PU.1和其他ETS家族成员，都有助于巨噬细胞的形成。一个共同的祖细胞产生组织巨噬细胞、骨髓树突状细胞（DC）和破骨细胞，它们是独特的、不可逆分化的亚系。

一旦通过血流分布，单核细胞就会持续进入身体的所有组织区室。不同器官中的常驻巨噬细胞群——例如Kupffer cells（肝脏）、alveolar macrophages（肺）和microglia（中枢神经系统，CNS）——适应其局部微环境。

二、巨噬细胞的先天性和获得性免疫激活

1.微生物刺激被模式识别受体识别，例如 Toll 样受体 (TLR)、CD14/脂多糖 (LPS) 结合蛋白和一系列非调理性受体。这些刺激诱导促炎细胞因子的产生，例如IFN-a/β 、活性氧 (ROS) 和一氧化氮 (NO)，然后产生受调节的抗炎反应。共刺激表面分子表达的增强有利于抗原呈递。SR-A和MR促进宿主以及外源配体的吞噬作用和内吞作用。

2.体液激活和吞噬作用由一些 Fc 和补体受体介导，而其他受体则下调反应。

3.经典激活是由启动刺激 IFN-γ 介导的，然后是微生物触发剂（LPS）。

4.|由IL-4和 IL-13 介导激活，通过共同受体链 (IL-4Ra) 发挥作用。

5.失活可以是先天性的，也可以是后天获得的。凋亡细胞的摄取或宿主分子的溶酶体储存会产生抗炎反应。

巨噬细胞与 T 细胞、成纤维细胞和基质通过一系列受体相互作用来调节细胞活性。细胞因子和糖皮质激素是有效的激活调节剂。病原体可以通过多种机制使巨噬细胞失活。

三、实验方案分享：

流式细胞术中小鼠骨髓来源巨噬细胞诱导分化的详细步骤

1.将分离的骨髓细胞以2×106/ml的浓度接种在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的IMDM培养基中，同时加入10 ng/ml M-CSF。

2.在第3天更换新鲜的BMDM生长培养基。

3.第7天，荧光团偶联抗体染色，用流式细胞术检测表达CD11b和F4/80的细胞来评估成熟BMDM的形成。

4. 第7天，成熟BMDM的形成后改为新鲜刺激培养基。

5.与100 ng/ml LPS或含有50 ng/ml IFNγ的100 ng/ml LPS共孵育，则向M1极化。与10 ng/ml IL-4，10 ng/ml IL-13共孵育，则向M2极化。

6. 用0.05%的胰蛋白酶将受刺激的细胞从培养皿中分离出来，然后用含有10%胎牛血清的PBS洗涤细胞两次。

7.荧光团偶联抗体染色，用流式细胞术检测CD11b,F4/80,CD86,CD206来评估细胞的极化水平

注：上述步骤仅供参考，各试剂用量根据实际情况进行优化！！！