一、背景介绍

小鼠肝癌细胞H22又称Hepatoma-22或Hepatoma 22，其分离自Balb/c小鼠腹水，由大连医科学院建立。H22细胞为悬浮细胞，细胞形态呈淋巴母细胞样。H22细胞常用于小鼠肝癌组织造模，在评估抗肿瘤药物的疗效、探究肿瘤微环境对肝癌进展的影响、揭示肝癌发生发展中的分子机制等方面的研究中有着广泛应用。

二、主要耗材、仪器及试剂

15ml离心管、50ml离心管、冻存管、巴氏滴管、培养瓶、封口膜、CO2培养箱、离心机、显微镜、生物安全柜、RPIM-1640、胎牛血清（FBS）、青-链霉素（双抗）、二甲基亚砜（DMSO）等等。

三、培养流程

1. 细胞复苏

1)用酒精棉球擦拭生物安全柜台面，准备好所需耗材，紫外30min，与此同时打开37℃恒温水浴箱对所用试剂进行温浴，同时也为复苏细胞做准备；

2)按照RPIM-1640+10%FBS+1% P/S的比例配制完全培养基，吹打混匀后按10倍细胞的体积（严格来讲是10倍细胞的体积，实际操作中适当减少用量对细胞并无影响）分装至15ml离心管中（最好依据所要复苏细胞的量提前计算要配制的完培用量及所用离心管的数目）；

3)从液氮拿出H22细胞，在37℃恒温水浴箱中快速晃动使其溶解（“快溶”），并将其转移至提前分装有完培的离心管中，吹打混匀；

4)1200rpm，离心3min；

5)弃去废液，重新加入新的完培，重悬细胞后将其加入培养瓶中（完培的用量视培养瓶大小而定，25cm2用量3-5ml；75cm2用量10-15ml）;

6)盖上培养瓶盖子，以划“十字”的方式晃动培养瓶，以使细胞分布均匀，镜下观察细胞均匀分布，置于37℃，5%-10% CO2培养箱中进行培养，完成细胞复苏。

2. 细胞传代

1)镜下观察细胞的生长情况，待细胞生长至80%以上时即可进行传代；

2)收集培养瓶中的细胞至15min离心管中，1200rpm，离心3min，弃去上清；

3)等待离心的过程中，取出T25培养瓶（此时培养瓶数应为之前培养瓶数的两倍哦），做好标记，并分别加入4ml完全培养基；

4)离心结束后弃去上清，向细胞沉淀中加入2ml完培，轻轻吹打重悬细胞，混匀后各取1ml细胞悬液分别加入新培养瓶中，盖上盖子，混匀置于培养箱中培养即可完成H22细胞传代。

3. 细胞冻存

1)从培养箱中取出培养瓶，转移细胞至15ml离心管中，1200rpm，离心3min；

2)等待离心的过程中，按照55% RPIM-1640+40% FBS+5% DMSO的比例配制冻存液；

3)离心结束后，弃去上清，向离心管中加入冻存液（冻存液用量视分装的管数而定），重悬细胞，分装于冻存管中，做好标记并封口；

4)将冻存管放入程序降温盒中（“慢冻”），置于-80℃冰箱中，第二天即可拿出细胞置于液氮罐中保存。

四、注意事项

1.一定要有无菌意识，以防细胞被污染，实验者双手及所有物品在进入生物安全柜和培养箱前均应用75%乙醇进行表面消毒；

2.复苏细胞时，不可让水浴锅的水位没过冻存管管口，冻存管中仅剩一小块冰块时即可从水浴锅中拿出，用其余温使其融化；

3.生物安全柜在使用前后要用75%乙醇擦拭消毒，并紫外30min；

4.重悬细胞时动作一定要轻柔，以防对细胞造成机械性损伤；

5.操作过程中手部不要从培养瓶瓶口、离心管管口等部位经过；

6.生物安全柜最好严格按照清洁区-半污染区-污染区进行分区，以免造成污染。