一、凝胶电泳技术原理概述

凝胶电泳主要利用琼脂糖凝胶作为电泳支持物。琼脂糖凝胶具有亲水性且不带电荷的特性。当将含有 DNA 样品的溶液上样到琼脂糖凝胶的加样孔中，并在凝胶两端施加电场时，DNA 分子由于自身携带的负电荷，会在电场力的作用下向正极移动。在移动过程中，不同大小的 DNA 片段受到凝胶孔径的阻滞作用不同.

较小的 DNA 片段能够更容易地穿过凝胶孔隙，因此在相同时间内移动的距离更远；而较大的 DNA 片段则受到较大的阻力，移动速度较慢。通过与已知分子量标准样（包含一系列已知大小的 DNA 片段）在凝胶中的迁移位置进行比较，就可以准确确定目标 DNA 片段的大小，从而实现对 DNA 的分离和鉴定。

 

二、凝胶电泳实验常见问题及解决方案

凝胶电泳带模糊或错位

1.可能原因

电泳条件不当：电场强度不稳定、电泳时间过长或过短、电泳缓冲液使用次数过多导致离子强度改变等，都可能影响 DNA 片段的迁移行为，使条带模糊或错位。

凝胶浓度选择不当：凝胶浓度过高，会使 DNA 片段迁移速度过慢，条带拥挤在一起难以分辨；凝胶浓度过低，则无法有效分离不同大小的 DNA 片段，导致条带模糊。

DNA 纯度不足：样品中含有蛋白质、RNA 等杂质，会影响 DNA 在电场中的迁移，造成条带异常。

2.解决办法

优化电泳条件：使用稳压电源确保电场强度稳定，根据目标 DNA 片段大小选择合适的电泳时间（一般每厘米凝胶长度电泳时间为 3 - 5V/cm），定期更换电泳缓冲液。

选择合适的凝胶浓度：对于较小的 DNA 片段（<1kb），可使用较高浓度的凝胶（如 1.5% - 2.0%）；对于较大的 DNA 片段（>1kb），则选择较低浓度的凝胶（如 0.8% - 1.2%）。

提高 DNA 纯度：在电泳前对 DNA 样品进行纯化处理，如采用酚氯仿抽提、试剂盒纯化等方法去除杂质。

 

什么条带都没有

1.可能原因

电极插反：导致电场方向错误，DNA 片段无法向正确方向迁移，从而无法在凝胶中形成条带。

未加 DNA 染色剂：如果没有添加染色剂（如溴化乙锭、SYBR Green 等），DNA 片段在凝胶中无法显色，即使有 DNA 迁移也无法观察到条带。

2.解决办法

检查电极连接是否正确：确保电极正负极连接无误，红色插头连接正极，黑色插头连接负极。

添加适量的 DNA 染色剂：按照染色剂的使用说明，在电泳前或电泳后将适量染色剂加入凝胶或电泳缓冲液中，使 DNA 能够显色。

 

单一条带变为模糊连续带

1.可能原因

PCR 产物太多或污染：过多的 PCR 产物上样到凝胶中，会使条带过于浓重，难以分辨出清晰的边界，呈现模糊状态；若存在污染（如其他 DNA 片段或杂质），也会干扰条带的正常形态。

扩增过程出现非特异产物：PCR 反应产生的非特异性扩增产物与目标产物一同电泳，会使原本单一的条带变得复杂，呈现模糊连续带。

2.解决办法

减少 PCR 产物量：适当稀释 PCR 产物后再上样，避免上样量过大。

进行二次 PCR：对于存在非特异性扩增的情况，可设计巢式引物进行二次 PCR，提高扩增的特异性，获得单一清晰的条带。

优化扩增条件：调整 PCR 反应参数，减少非特异性扩增的产生。

 

凝胶上出现额外条带

1.可能原因

污染：包括实验环境中的 DNA 污染（如气溶胶携带的 DNA）、试剂污染（如引物、dNTP 等试剂受到其他 DNA 污染）以及样本之间的交叉污染等。

异源 DNA 引入：在实验操作过程中，不小心引入了其他来源的 DNA，如实验人员的皮肤细胞、头发等中的 DNA。

DNA 降解产生片段：DNA 样品在保存或处理过程中发生降解，产生了大小不同的片段，在电泳中形成额外条带。

2.解决办法

检查实验环境是否干净：定期清洁实验室台面、仪器等，使用紫外线照射实验区域进行消毒，减少环境中的 DNA 污染。

净化实验样本：对样本进行严格的处理和纯化，确保样本的纯度和质量。

加强实验管道控制：严格遵守实验操作规程，在不同实验步骤之间更换手套、移液器吸头，设置合理的实验分区，避免交叉污染。

 

凝胶电泳出现弯曲条带

1.可能原因

DNA 超量：上样的 DNA 量过多，会导致条带在凝胶中扩散不均匀，形成弯曲形状。

凝胶偏心或变形：在制备凝胶过程中，凝胶模具放置不均匀或受到外力挤压等，使凝胶形状不规则，影响 DNA 片段的迁移路径，导致条带弯曲。

2.解决办法

减少 DNA 用量：根据凝胶的大小和检测灵敏度，合理控制上样量，避免 DNA 过量。

调整凝胶制备过程：确保凝胶模具水平放置，在凝胶凝固过程中避免震动和挤压，保证凝胶形状规则。

保持电泳条件稳定：在电泳过程中，保持电泳槽水平放置，避免电流不稳定或温度变化等因素影响 DNA 迁移。

 

凝胶电泳条带浓度差异过大

1.可能原因

PCR 产物量不均一：不同样本或同一反应体系中不同区域的 PCR 扩增效率不同，导致产物量差异较大，在电泳中表现为条带浓度差异。

电泳条件不统一：如电泳时间不一致、电泳缓冲液在不同泳道中的离子浓度不均匀等，会使 DNA 片段在不同泳道中的迁移速度不同，造成条带浓度差异。

2.解决办法

确保 PCR 产物量均一：优化 PCR 反应条件，提高扩增效率的一致性，对产物进行定量后再上样，保证上样量相同。

优化电泳条件：严格控制电泳时间，确保每个泳道中的电泳缓冲液离子浓度相同，可在电泳前充分混匀缓冲液。

检测电泳槽结构是否均匀：检查电泳槽是否存在损坏或不均匀的情况，如有问题及时更换或调整。

 

凝胶电泳条带过曝

1.可能原因

染色剂过量：过多的染色剂会使 DNA 条带过度染色，导致信号过强，出现过曝现象，无法清晰分辨条带细节。

暴露时间过长：在观察或拍照过程中，凝胶与染色剂或激发光源的接触时间过长，也会使条带过度显色。

2.解决方法

控制染色剂用量：按照染色剂的推荐浓度使用，避免染色剂过量。

减少暴露时间：在观察和拍照时，尽量缩短凝胶与染色剂或激发光源的接触时间，获取合适的图像。

 

凝胶电泳中 DNA 迁移速度过快或过慢

1.可能原因

电泳缓冲液离子浓度问题：缓冲液离子浓度过高，会增加 DNA 片段的迁移阻力，使迁移速度变慢；离子浓度过低，则会降低缓冲能力，导致 DNA 迁移速度加快。

电场强度不均等：电泳槽两端电极距离不均匀、电极表面不平整或电泳过程中电压不稳定等，会造成电场强度不均，使 DNA 片段在不同位置受到的电场力不同，从而迁移速度不一致。

2.解决方法

调整电泳缓冲液离子浓度：根据实验要求，准确配制电泳缓冲液，确保离子浓度在合适范围内。

平衡电场强度：检查电泳槽电极