一、常用表达载体
1.pPIC系列载体
pPICZαA：载体大小为3593bp，包含AOX1启动子，利用ɑ-因子分泌重组蛋白，具有c-myc抗原决定簇和6×HIS标签用于检测和纯化重组融合蛋白，载体拥有Zeocin博来霉素抗性，插入基因必须包含起始密码子ATG。
pPIC9K：载体大小为9276bp，是融合表达载体，包含AOX1启动子，利用ɑ-因子分泌信号肽分泌表达蛋白基因，拥有氨苄及卡纳霉素抗性，在毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。
pPIC9：分泌表达载体，适用于毕赤酵母的蛋白表达。
2.pGAP系列载体
以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP）启动子驱动基因表达，是组成型启动子，无需诱导物即可实现基因的持续表达，适用于需要稳定表达蛋白的场景。
3.其他载体
pHIL-S1、pYAM75P：分泌表达载体，可用于毕赤酵母的蛋白表达。
胞内表达载体：如pPIC3K、pPICZA、pPIC3.5K等，适用于外源蛋白属于细胞溶质型的无糖基化蛋白的情况。
二、基因改造技术
1.基于线性化质粒载体的同源重组
原理：将外源基因的表达盒通过线性化载体同源重组稳定插入毕赤酵母基因组，实现目标基因的插入或替换。
特点：整合载体如pPIC9K、pPIC3.5K和pAO815等可实现单拷贝或多拷贝的基因整合，但同源重组效率和线性载体转化效率较低，需选择高效转化方法（如电穿孔）和较大线性载体数量。
2.基于CRISPR/Cas9的基因编辑
原理：利用CRISPR/Cas9系统对毕赤酵母基因组进行定点切割，通过细胞自身的DNA修复机制实现基因敲除、插入或替换。
特点：作为新一代基因编辑技术，CRISPR/Cas9具有高效、便捷的优点，可显著提高基因编辑效率。
3.基于CRISPR/Cas12的基因编辑
原理：利用CRISPR/Cas12a系统对毕赤酵母基因组进行编辑，实现多基因快速导入和大片段DNA删除。
特点：单基因编辑效率达99%±0.8%，双基因编辑效率达65%±2.5%至80%±3%，三基因编辑效率达30%±2.5%，可作为CRISPR/Cas9系统的有效补充。
4.启动子工程
原理：通过改造或合成启动子，调控基因的表达水平和时机。
应用：如构建Tet-On诱导系统，通过脱水四环素（aTc）诱导激活同源重组相关基因的表达，提高基因编辑准确度，同时不影响细胞生长和产物合成。
5.代谢工程
原理：通过改造毕赤酵母的代谢途径，提高目标产物的合成效率。
应用：如优化甲醇利用途径，提高毕赤酵母以甲醇为唯一碳源生长和合成高附加值产物的能力。
