MLPA技术，全称为多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification），是一种基于PCR（聚合酶链式反应）的分子生物学技术。
MLPA探针示意图
一、基本原理
MLPA技术的基本原理涉及多个步骤，如下图所示：
1.靶序列变性和杂交
变性涉及退火DNA链的分离，使双链DNA变成单链。将特异性探针与待检测的DNA靶序列进行杂交。可以同时使用多达60个探头分析每个样本，从而针对不同的位点。这些探针具有引物序列，在扩增过程中与PCR -引物结合。所有不同的探针都有相同的引物结合序列，此外，探针还具有与目标位点互补的杂交序列，使探针能够与DNA结合。两种探针将在DNA链的相邻位点杂交。这对探针中的一个包含一个填充序列，每个目标位点的填充序列长度不同。填充序列的长度在不同的探针之间变化，允许多路复用。所以每个放大产物都有一个唯一的长度。
2.连接反应
使用连接酶将两个相邻的探针连接成一个完整的分子，这个过程高度特异，只有当探针与靶序列完全互补时才能进行。在这个步骤中，使用一种叫DNA连接酶的特定的酶，它与已经在目标位点DNA链相邻位点杂交的探针结合。MLPA中使用的连接酶是ligase-65，这是一种依赖于DNA的连接酶。
3.PCR扩增
在PCR步骤中，加入聚合酶、dNTPs和正向、反向引物。由于所有的探针都有相同的PCR-引物序列，因此只需要添加一对通用引物就可以研究我们所有的目标。正向引物荧光标记，使分析过程可视化和得以定量。
4.电泳分离与数据分析
扩增产物通过毛细管电泳进行分离，并将不同长度的片段显示为峰值模式，称为电泳图。每个探针上的填充序列不同，每个扩增子都有不同的已知大小。使用分析软件对收集的数据进行分析，以判断靶序列的拷贝数或序列变异情况。
二、技术优势
1.高效性：一次反应可以检测多达45至50个核苷酸序列的拷贝数变化，大大提高了工作效率 。
2.特异性：由于连接反应的高度特异性，MLPA技术可以准确地区分靶序列的微小变化。
3.灵活性：通过选择不同的探针，可以灵活地检测不同基因区域的拷贝数变异和序列变异。
4.精确性：MLPA技术具有高度的准确性和可靠性，可以检测到低拷贝数变异和细微的序列变异。
三、应用领域
MLPA技术已经广泛应用于多个领域和多种疾病的研究中，包括但不限于：
1.遗传疾病诊断：如智力低下、遗传性乳腺癌、结肠癌、脊髓性肌萎缩症、假性肥大型肌营养不良等。
2.肿瘤研究与癌症诊断：用于检测肿瘤相关基因的拷贝数变异和突变情况，为肿瘤的分型、预后和治疗提供依据。
3.产前诊断：通过对羊水或绒毛样本的检测，可以及时发现胎儿是否存在染色体异常或其他遗传缺陷。
四、局限性
尽管MLPA技术具有诸多优势，但也存在一些局限性。
1.样本要求：需要精确测量DNA的浓度，且样本容易被污染。
2.检测范围：主要用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。
3.技术难度：设计特异性引物和准确解读结果需要经验丰富的科研人员。
