一. 实验准备工作
实验试剂：
1.冻存液：（10%DMSO 50%-90%血清的DMEM或者直接使用商品化冻存液）；0%血清的细胞培养液；0.25% 胰蛋白酶等。
2.实验仪器：-80冰箱；液氮罐；离心机；水浴锅等。
二. 实验方法
细胞冻存
1.细胞处于对数生长期时准备冻存，在冻存前一天换液。
2.将细胞培养基弃掉，用PBS清洗一次，然后加入0.25% 胰蛋白酶消化加入量是10cm dish加入1ml胰酶，其他孔径培养皿细胞按比例加入胰酶消化。消化的时候将细胞放入细胞培养箱。
3.胰酶消化时间根据细胞类型不同，一般Hela 2min即可，其他类型的细胞消化时间需要尝试，第一次消化的时候，可以隔半分钟在显微镜下看一下细胞的消化情况。一般镜下50-70%变圆就可以停止消化。（注意，这一步非常关键，一些敏感脆弱的细胞如果掌握不好消耗时间的话，对细胞伤害非常大）
4.加带有10%FBS的细胞培养液终止消化，加入胰酶3倍的量即可。
5.用枪头轻轻吹吸，然后将液体全部转移到收集管中，200g离心5min。
6.弃上清液，加入冻存液。（每107细胞用3ml，1ml/每冻存管）
7.将细胞分装到冷冻管中，将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时做好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。
8.将冻存管放入梯度降温盒（目前很多商品化的冻存液可以不用降温盒），置于-80存放过夜，次日转入液氮中。
细胞复苏
1.冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
2.解冻后的细胞加入适量培养基中，离心，200g离心5min
3.弃上清，用10ml培液重悬。转入10cm dish中进行培养
4. 细胞贴壁生长后换液，一般过5-10个小时左右。第二天观察生长状态，传代。
